郭　寒，葛　娟，李　鑫，古麗米熱·阿力木，何大俊

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

正交試驗(yàn)優(yōu)化黑果懸鉤子莖、葉總黃酮的提取純化及其抗氧化活性

郭寒，葛娟，李鑫，古麗米熱·阿力木，何大俊*

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了黑果懸鉤子（Rubus caesius L.）莖和葉總黃酮的提取工藝，通過清除DPPH自由基、ABTS+·的方法測定了黑果懸鉤子莖和葉的抗氧化活性。優(yōu)化的總黃酮提取工藝為：提取溫度80 ℃、提取時(shí)間70 min、乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶90（g/mL）。通過比較AB-8等14 種大孔樹脂對黑果懸鉤子莖、葉總黃酮的吸附分離效果，從中篩選出AB-8大孔樹脂是理想的吸附 劑。通過單因素試驗(yàn)，確定AB-8大孔樹脂對黑果懸鉤子總黃酮分離純化的最優(yōu)工藝為：上樣流速1 mL/min、上樣液總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg/mL、上樣體積80 mL，吸附飽和平衡后，以40 mL 60%乙醇溶液1.5 mL/min的流速動(dòng)態(tài)洗脫。經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后，提取液的總黃酮含量和抗氧化能力顯著提高，葉和莖總黃酮含量為純化 前的1.4 倍和2.4 倍，葉和莖的的ABTS+·清除能力分別為純化前的1.7 倍和 2.5 倍，DPPH自由基清除能力分別為純化前的1.7 倍和2.6 倍。這些結(jié)果表明：黑果懸鉤子葉和莖均具有較高的總黃酮含量和明顯的抗氧化活性，是潛在的天然抗氧化劑資源。

黑果懸鉤子；總黃酮；提取純化；抗氧化性

黑果懸鉤子（Rubus caesius L.）又稱歐洲木莓，果實(shí)為黑色小漿果，屬于蔓生灌木，生于谷地灌叢或林緣，分布于新疆額敏、塔城、伊寧、尼勒克等地［1］，為新疆所特有的懸鉤子屬植物，長期以來作為哈薩克藥的常用藥食同源植物［2］。研究表明，多種懸鉤子屬植物具有抗氧化等生物活性，其活性與其中含有的黃酮類、多酚類、鞣質(zhì)、鞣花酸類成分密切相關(guān)［3-7］。黑果懸鉤子果實(shí)中含有花青素、糖類、氨基酸、油脂類等［8］，黑果懸鉤子葉提取物含有多酚、黃酮類等成分，并具有較高的抗氧化活性［9］，但是對黑果懸鉤子莖的化學(xué)成分和生物活性的研究未見報(bào)道。明確其中的活性成分對于開發(fā)懸鉤子屬植物的功能食品和植物藥具有重要的作用。本研究對黑果懸鉤子莖和葉的總黃酮提取純化工藝和抗氧化活性進(jìn)行研究，以期從中發(fā)現(xiàn)具有高活性、低毒性的抗氧化劑，為開發(fā)利用新疆的黑果懸鉤子資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黑果懸鉤子（Rubus caesius L.）莖、葉采集于新疆額敏縣兵團(tuán)第九師165團(tuán)，由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室徐文斌老師鑒定為黑果懸鉤子莖、葉。

蘆?。兌取?8%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS） 美國Sigma公司；AB-8等14 種大孔樹脂滄州寶恩吸附材料科技有限公司；甲醇、三氯化鋁、過硫酸鉀等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；S54紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；BSA124S萬分之一電子天平 德國Sartorius公司；KQ-100型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司；FW型高速萬能粉碎機(jī) 北京永光明醫(yī)療儀器廠；DK-S26水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3方法

1.3.1原料處理

將黑果懸鉤子莖、葉于50 ℃烘干后，分別用粉碎機(jī)粉碎，過孔徑為1.2 mm篩，制備相同粒徑的莖、葉粉末，再用石油醚脫葉綠素［10］，直至石油醚變?yōu)闊o色為止，于50 ℃干燥至質(zhì)量恒定，備用。

1.3.2總黃酮含量的測定

根據(jù)何書美等［11］的方法測定總黃酮含量。分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（質(zhì)量濃度0.4 mg/mL）0.100、0.175、0.250、0.325、0.400 mL于試管中，加入50%乙醇溶液至3 mL，再加入1 mL pH 5.5乙酸鹽緩沖液，2 mL 1.5%三氯化鋁溶液，混勻，靜置30 min，同時(shí)設(shè)置空白對照，于415 nm波長處測吸光度。以質(zhì)量（mg）和吸光度進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：y=6.650x，R2=0.999。結(jié)果表明，在0～0.16 mg范圍內(nèi)吸光度與蘆丁質(zhì)量線性關(guān)系良好。樣品液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定其在415 nm波長處的吸光度。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的總黃酮含量，結(jié)果以每克樣品中含有相當(dāng)蘆丁的毫克數(shù)表示，單位為mg/g。

1.3.3抗氧化活性測定

1.3.3.1DPPH法［12-13］

稱取0.007 9 g DPPH用甲醇溶解，用甲醇定容于100 mL容量瓶（濃度2.0×10－4mol/L）。分別取各樣液適量，加入甲醇稀釋至5 mL再加入2 mL DPPH（濃度為2.0×10－4mol/L）溶液混勻，30 min后在517 nm波長處測量其吸光度，控制樣本用甲醇代替提取液，以純甲醇為參比溶液。對DPPH自由基的清除率按式（1）計(jì)算：

式中：A1為控制樣本的吸光度；A2為測試樣本的吸光度。

另以不同濃度（0、400、800、1 200、1 600、2 000 μmol/L）的Trolox清除DPPH自由基的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黑果懸鉤子葉、莖提取物的Trolox當(dāng)量抗氧化能力TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）。得回歸方程y=0.047 3x（R2=0.997 6），其中y為清除率，x為Trolox濃度/（μmol/L）。

1.3.3.2ABTS法［14］

稱取0.41 g ABTS，用20 mmol/L乙酸鹽緩沖液（pH 4.5）溶解并定容至100 mL，配制成7.4 mmol/L ABTS儲備液。稱取0.070 3 g過硫酸鉀，加水溶解定容至100 mL，配制成2.6 mmol/L過硫酸鉀儲備液。將配制好的ABTS儲備液與過硫酸鉀儲備液等體積混合，在室溫黑暗條件下放置12 h，再用20 mmol/L乙酸鹽緩沖液（pH 4.5）稀釋45～55倍，以20 mmol/L乙酸鹽緩沖液（pH 4.5）為空白對照，使ABTS工作液在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。

取各樣液適量于試管中，再加入pH4.5乙酸鹽緩沖液至1 mL，然后加入4 mL ABTS工作液振蕩10 s以充分混勻，靜置10 min，用乙酸鹽緩沖液作為參比，測定734 nm波長處的吸光度A4。用乙酸鹽緩沖液代替樣液加入4 mL ABTS工作液，在734 nm波長處測得吸光度A3。對ABTS+·的清除率按式（2）計(jì)算：

式中：A3為控制樣本的吸光度；A4為測試樣本的吸光度。

另以不同濃度（0、400、800、1 200、1 600、2 000 μmol/L）的Trolox清除ABTS+·的能力做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黑果懸鉤子葉、莖提取物的Trolox當(dāng)量抗氧化能力TEAC。得回歸方程：y=0.046 3x（R2=0.999 7），其中y為清除率，x為Trolox濃度/（μmol/L）。

1.3.4黑果懸鉤子葉和莖總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

考察溶劑種類、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對總黃酮提取量和抗氧化活性的影響，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值［15-16］。

1.3.4.1溶劑種類對總黃酮提取量的影響

固定料液比1∶40（g/mL）、室溫超聲提?。üβ蕿?00 W）、提取時(shí)間30 min，探討水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯5 種溶劑對總黃酮提取量的影響。

1.3.4.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響

固定料液比1∶40（g/mL）、室溫超聲提?。üβ蕿?00 W）、提取時(shí)間30 min，探討乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、40%、60%、80%、100%）對總黃酮提取量的影響。

1.3.4.3提取溫度對總黃酮提取量的影響

固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間30 min，探討提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對總黃酮提取量的影響。

1.3.4.4提取時(shí)間對總黃酮提取量的影響

固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度80 ℃，探討提取時(shí)間（15、30、45、60、75 min）對總黃酮提取量的影響。

1.3.4.5料液比對總黃酮提取量的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間30 min，探討料液比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL））對總黃酮提取量的影響。

1.3.5黑果懸鉤子葉總黃酮提取的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響因素，每因素3 個(gè)水平，對黑果懸鉤子葉的總黃酮提取工藝進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1　黑果懸鉤子葉總黃酮提取的LL9（334）正交試驗(yàn)因素水平表Table1　Factors and their coded levels for orthogonal array design

1.3.6黑果懸鉤子葉和莖總黃酮的純化工藝優(yōu)化［17-19］

1.3.6.1大孔樹脂的篩選

分別稱取已預(yù)處理的AB-8、D101等14 種大孔樹脂各0.5 g，分別加入莖和葉的提取液20 mL，在120 r/min的條件下振搖6 h，吸取0.5 mL測總黃酮質(zhì)量濃度，按式（3）計(jì)算吸附量。吸附過的大孔樹脂抽干，分別加入20 mL無水乙醇解吸附，于120 r/min的條件下振搖11 h，測定解吸液中的總黃酮質(zhì)量濃度，按式（4）計(jì)算解吸量。根據(jù)吸附量和解吸量對幾種大孔樹脂進(jìn)行篩選。

式（3）、（4）中：Q吸為吸附量/（mg/g）；ρ0為吸附前樣液中總黃酮的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρe為吸附后剩余液中總黃酮的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V0為加入的樣液體積/mL；m為干樹脂質(zhì)量/mg；Q解為解吸量/（mg/g）；ρd為解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1為加入的解吸液體積/mL。

1.3.6.2靜態(tài)吸附時(shí)間的選擇

稱取2 份經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂各0.5 g，分別加入20 mL莖、葉提取液進(jìn)行靜態(tài)吸附，室溫條件下靜置，間歇振蕩，分別于不同時(shí)間測定剩余總黃酮質(zhì)量濃度直至吸附平衡。

1.3.6.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮靜態(tài)解吸的影響

稱取14 份經(jīng)預(yù)處理的AB-8樹脂各0.5 g，分別加入相同質(zhì)量濃度的莖和葉提取液20 mL于120 r/min的條件下振搖6 h，測得吸附后的質(zhì)量濃度ρe，計(jì)算樹脂總黃酮吸附量。將吸附平衡后的樹脂取出，抽濾，濾出的樹脂中分別加入不同體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%）乙醇溶液20 mL，于120 r/min的條件下振搖12 h，測得解吸液總黃酮質(zhì)量濃度ρd，計(jì)算解吸率。比較不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的靜態(tài)解吸效果。

1.3.6.4最佳上樣流速的確定

將預(yù)處理好的8 份AB-8 樹脂各2.0 g濕法裝入10 mm× 200 mm層析柱，將相同質(zhì)量濃度（0.32 mg/mL）的100 mL葉和莖提取液分別以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min的流速上柱，收集流出液，測定流出液的體積及總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算不同上樣流速條件下樹脂對總黃酮的吸附量。

1.3.6.5最佳上樣體積的確定

將2 份預(yù)處理好的AB-8樹脂各2.0 g濕法裝入10 mm×200 mm層析柱，將相同質(zhì)量濃度（0.32 mg/mL）的葉和莖提取液以1 mL/min的流速上樣，每10 mL為一個(gè)流份收集，測定每個(gè)流分中的總黃酮質(zhì)量濃度，繪制泄露曲線，確定最佳上樣體積。

1.3.6.6最佳洗脫流速的確定

按確定的最佳吸附條件上柱，待總黃酮吸附完全后，水洗除去雜質(zhì)，再用60%乙醇溶液分別以0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min速率進(jìn)行洗脫，洗脫液用量為72 mL。測定洗脫液中的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸量，比較不同洗脫流速對解吸效果的影響。

1.3.6.7 最佳洗脫體積的確定

按確定的最佳吸附條件上柱，用60%乙醇溶液，以1.5 mL/min的流速洗脫，每3 mL為一個(gè)流份收集，測定每個(gè)流份的總黃酮質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線，以確定最佳的洗脫體積。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1黑果懸鉤子葉和莖總黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1溶劑種類的影響

表2　溶劑種類對總黃酮提取量和抗氧化活性的影響Table2　Effect of solvents on the extraction rate and antioxidant activity of flavonoiddss

由表2可知，黑果懸鉤子葉和莖在用不同溶劑提取時(shí)，總黃酮提取量和抗氧化活性均有顯著性差異，其中甲醇提取液中總黃酮提取量最高，其抗氧化活性也最高，但其毒性高，不適合作為提取溶劑；水提取液中的總黃酮含量和抗氧化活性次之，但糖等雜質(zhì)的含量高，水的沸點(diǎn)高，不利于樣品后續(xù)的濃縮；乙醇的總黃酮提取量和抗氧化活性高于丙酮和乙酸乙酯，且毒性小，沸點(diǎn)低，易于濃縮，適合葉和莖總黃酮、多酚的提取，在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇乙醇作為最佳溶劑進(jìn)行提取。

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

表3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量和抗氧化活性的影響Table3　Effect of ethanol concentration on the extraction rate and antioxidant activity of flavonoiddss

由表3可知，黑果懸鉤子葉和莖用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液提取時(shí)，總黃酮提取量和抗氧化活性均有顯著性差異；在一定范圍內(nèi)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高總黃酮提取量和抗氧化活性也升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮提取量和抗氧化活性最高，隨后總黃酮提取量和抗氧化活性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而降低。這可能是60%乙醇的極性與葉和莖中總黃酮化合物的極性最相近，此時(shí)的總黃酮溶解度最高。在后續(xù)試驗(yàn)中，以60%作為最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取。

2.1.3提取溫度的影響

表4　提取溫度對總黃酮提取量和抗氧化活性的影響Table4　Effect of temperature on the extraction rate and antioxidant activity of flavonoidss

由表4可知，黑果懸鉤子葉和莖在40～80 ℃溫度范圍內(nèi)，總黃酮提取量和抗氧化活性隨著溫度的升高而升高，在90 ℃時(shí)，總黃酮提取量和抗氧化活性有所下降，說明在一定的溫度范圍內(nèi)，總黃酮成分的滲透、擴(kuò)散和溶解速度加快，90 ℃時(shí)可能由于溫度太高使部分總黃酮成分降解。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，以80 ℃作為最佳的提取溫度。

2.1.4提取時(shí)間的影響

表5　提取時(shí)間對總黃酮提取量和抗氧化活性的影響Table5　Effect of extraction time on the extraction rate and antioxidant activity of flavonoiddss

由表5可知，在15～60 min范圍內(nèi)，黑果懸鉤子葉和莖的總黃酮提取量和抗氧化活性呈現(xiàn)出隨提取時(shí)間延長而增加的趨勢，超過60 min后，總黃酮提取量和抗氧化活性增幅緩慢甚至有些下降，并且差異不顯著。說明在提取60 min時(shí)，總黃酮提取量基本達(dá)到飽和，在后續(xù)試驗(yàn)中，以60 min作為最佳的提取條件。

2.1.5料液比的影響

由表6可知，黑果懸鉤子葉和莖總黃酮提取量和抗氧化活性隨著溶劑用量的增大而增大，料液比在1∶80后，總黃酮提取量和抗氧化活性有所下降，綜合考慮提取效率和提取成本，料液比宜在1∶80（g/mL）左右。

表6　料液比對總黃酮提取量和抗氧化活性的影響Table6　Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction rate and antioxidant activity of flavonoidss

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果

表7　黑果懸鉤子葉總黃酮LL9（334）提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table7　Orthogonal array design scheme and corresponding results

由表7可知，影響黑果懸鉤子葉的總黃酮提取量的4 個(gè)主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即黑果懸鉤子葉的總黃酮的提取工藝確定為提取溫度80 ℃、提取時(shí)間70 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶90。在此條件下，果懸鉤子葉的總黃酮提取量達(dá)到（16.32±0.44）mg/g。其總黃酮含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出同屬植物樹莓、黑莓等［20-21］，這除了種的差異之外還可能和地區(qū)差異有關(guān)［22］。

2.3黑果懸鉤子莖和葉總黃酮提取量和抗氧化活性的比較

表8　黑果懸鉤子葉和莖總黃酮提取量和抗氧化活性的比較Table8　Comparison of extraction rates of flavonoids and antioxidant activity between stems and leaves off R. caesiiuuss L.

利用上述單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的葉總黃酮最佳提取工藝對莖和葉總黃酮進(jìn)行提取，由表8可知，葉的總黃酮提取量和抗氧化活性均高于莖。其中葉的總黃酮提取量為（16.32±0.44）mg/g；葉提取物對ABTS+·和DPPH自由基清除能力較高，分別為（1 151.91±41.64）、（964.41±81.59）μmol/g。利用ABTS法和DPPH法測得抗氧化活性具有相似的趨勢，即總黃酮含量越高，其抗氧化活性越高，提示黑果懸鉤子葉中總黃酮成分可能是主要的抗氧化活性成分。測得的ABTS+·清除能力偏高，這和Sariburun等［4］測得結(jié)果不一致，可能是黑果懸鉤子葉和莖中含有一些不容易和DPPH自由基反應(yīng)的成分。

2.4黑果懸鉤子葉和莖總黃酮純化工藝優(yōu)化

2.4.1大孔樹脂的選擇

圖1　14種不同樹脂對黑果懸鉤子葉和莖總黃酮的吸附和解吸效果Fig.1　Results of adsorption and desorption for flavonoids from stems and leaves of R. caesius L. by 14 macroporous resins

由圖1可知，14 種樹脂對黑果懸鉤子莖和葉總黃酮的吸附和解吸效果不同，其中AB-8樹脂對黑果懸鉤子葉的吸附量和解吸量最大，分別達(dá)到（6.25±0.05）mg/g和（5.42±0.03）mg/g。AB-8樹脂對黑果懸鉤子莖的解吸量最大，為（4.11±0.09）mg/g，吸附量雖未達(dá)到最大，但和最大值非常接近。故選用AB-8作為黑果懸鉤子葉和莖總黃酮純化的樹脂，這可能和同一植物葉和莖含有相似的化學(xué)成分有關(guān)。

2.4.2靜態(tài)吸附時(shí)間的確定

圖2　AB-8大孔樹脂靜態(tài)動(dòng)力學(xué)吸附曲線Fig.2　Static adsorption curves of AB-8 macroporous resin

由圖2可知，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的延長吸附速率變得緩慢，吸附量逐漸達(dá)到飽和，在4 h時(shí)基本達(dá)到吸附平衡，之后隨著吸附時(shí)間的延長吸附量雖然有所增加但是增加速率很低。因此，在靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中選擇4 h為吸附時(shí)間。

2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對靜態(tài)解吸的影響

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on desorption rate

由圖3可知，隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率也在不斷的升高。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，對黑果懸鉤子葉和莖總黃酮的解吸率最大，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，解吸率又逐漸降低，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為洗脫劑。

2.4.4最佳上樣流速的確定

圖4　上樣流速對吸附量的影響Fig.4　Influence of sample loading flow rate on adsorption capacity

由圖4可知，隨著吸附流速增加，樹脂吸附量逐漸下降。流速低，總黃酮與樹脂的接觸時(shí)間延長，有利于其從液相擴(kuò)散到樹脂相，有利于吸附；流速過快，被吸附物質(zhì)來不及擴(kuò)散到樹脂表面就會發(fā)生泄漏流速過快，會提前泄漏；因此，流速低有利于總黃酮的充分吸附，但會使生產(chǎn)周期延長，成本增加。綜合考慮，選定上樣流速為1 mL/min，此時(shí)，樹脂對葉、莖總黃酮的吸附量分別為12.50 mg/g和14.30 mg/g。

2.4.5最佳上樣體積的確定

圖5　總黃酮的泄露曲線Fig.5　Leakage curves of leaf and stem flavonoids

如圖5所示，當(dāng)上樣體積為80 mL時(shí)，總黃酮的泄漏率開始明顯增加，上樣量越大，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度越大，浪費(fèi)嚴(yán)重；反之，上樣量太小，樹脂處理量較小，純化效率低。綜合考慮，應(yīng)選擇上樣體積為80 mL。

2.4.6 最佳洗脫流速的確定

圖6　洗脫流速對樹脂解吸性能的影響Fig.6　Effect of elution flow rate on desorption rate

由圖6可知，洗脫流速對解吸量的影響不大，在流速1.5 mL/min以下，莖和葉的總黃酮解吸量分別保持在10 mg/g及9 mg/g以上的水平。當(dāng)洗脫流速為2 mL/min時(shí)解吸量稍有所下降，為了節(jié)省洗脫時(shí)間，提高工作效率，選用1.5 mL/min作為最佳洗脫流速。

2.4.7最佳洗脫體積的確定

圖7　洗脫曲線Fig.7　Dynamic desorption curves

由圖7可知，當(dāng)洗脫體積達(dá)到30mL時(shí)洗脫液總黃酮質(zhì)量濃度接近于零，且基本不再變化，說明30 mL洗脫劑基本洗脫完全，為了保證樹脂中的總黃酮完全洗脫下來，用40 mL作為最佳洗脫體積。此時(shí)，樹脂對葉和莖的總黃酮解吸率分別可達(dá)75.28%和70.28%。

2.5AB-8樹脂對黑果懸鉤子葉和莖總黃酮的純化效果

在上述AB-8大孔樹脂最佳純化條件下，對黑果懸鉤子葉和莖提取液分別進(jìn)行純化，比較純化前后的總黃酮含量和抗氧化活性，結(jié)果見表9。經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后，提取液的總黃酮含量和抗氧化能力顯著提高。純化后，葉和莖總黃酮含量為純化前的1.4 倍和2.4 倍，葉和莖的ABTS+·清除能力分別為純化前的1.7 倍和2.5倍，DPPH自由基清除能力分別為純化前的1.7 倍和2.6倍。

表9　純化前后總黃酮含量和抗氧化能力的比較Table9　Comparison of total flavonoids content and antioxidant activity before and after purificatioonn

3　結(jié) 論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，不同因素對黑果懸鉤子葉總黃酮提取量和抗氧化活性的影響力大?。阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。得到的優(yōu)化提取工藝條件：提取溫度80 ℃、提取時(shí)間70 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%及料液比1∶90。這些提取條件對于黑果懸鉤子葉、莖的總黃酮提取量和抗氧化活性表現(xiàn)出相似的作用，可能是由于同一植物葉和莖含有相似的總黃酮化合物。在不同提取條件下，葉和莖的抗氧化活性都是隨著總黃酮含量增加而增加，總黃酮含量與ABTS+·、DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.997 9和0.975 7，提示其中總黃酮成分可能是主要的抗氧化活性成分。在此優(yōu)化提取條件下，黑果懸鉤子葉的總黃酮含量和抗氧化活性均高于莖，并且黑果懸鉤子葉比莖有更大的生物量，說明黑果懸鉤子葉是一種很好的潛在抗氧化植物資源。

確定的黑果懸鉤子葉和莖總黃酮的純化工藝為用AB-8大孔樹脂純化、上樣流速1 mL/min、上樣液總黃酮質(zhì)量濃度0.32 mg/mL、上樣體積80 mL，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，樹脂對葉和莖的總黃酮吸附量分別達(dá)到12.50 mg/g和14.30 mg/g。吸附平衡后，以40 mL 60%乙醇溶液1.5 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，樹脂對葉和莖的總黃酮解吸率分別可達(dá)75.28%和70.28%，洗脫峰相對集中、對稱，無拖尾現(xiàn)象。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后，葉的總黃酮含量約為純化前的1.4 倍，莖的總黃酮含量約為純化前的2.4 倍，葉和莖的的ABTS+·清除能力分別為純化前的1.7 倍和2.5 倍，DPPH自由基清除能力分別為純化前的1.7 倍和2.6 倍。說明AB-8大孔吸附樹脂對黑果懸鉤子總黃酮成分具有較好的吸附、富集作用，適用于黑果懸鉤子總黃酮的分離純化。

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Extraction， Purification and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from the Leaves and Stems of Rubus caesius L.

GUO Han， GE Juan， LI Xin， Gulimire·ALIMU， HE Dajun*
（College of Life Science， Shihezi University， Shihezi 832000， China）

The extraction of flavonoids from the leaves and stems of Rubus caesius L. was optimized by single factor experiments and an orthogonal array design. Antioxidant activity of flavonoids extracts was determined by 2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） （ABTS）， 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radical scavenging assays. The optimal extraction conditions for total flavonoids were determined as follows： 80 ℃， 70 min， and 60% ethanol as the extraction solvent with a solid- to-liquid ratio of 1：90 （g/mL）. By comparing the adsorption and separation efficiencies of flavonoids with 14 different macroporous resins， AB-8 resin was selected as the most efficient adsorbent as it had the best adsorption and desorption capa city for flavonoids from R. caesius L. By single factor experiments， the optimal purification conditions for crude flavonoids from R. caesius L. leaves and stems were established as follows： sample loading flow rate， 1 mL/min；flavonoids concentration of sample， 0.32 mg/mL； sample volume， 80 mL； desorption solvent， 40 mL of 60% ethanol； and desorption flow rate， 1.5 mL/min. After being separated and purified by AB-8 resin， both total flavonoids content and total antioxidant capacity were significantly improved. The total flavonoids contents from leaves and stems were increased by 1.4 and 2.4 times， the ABTS radical scavenging rates by 1.7 and 2.5 times， and the DPPH radical scavenging rates by 1.7 and 2.6 times， respectively. These results demonstrate that the leaves and stems of R. caesius L. have high flavonoids contents and antioxidant activity， and can be potential sources of natural antioxidants.

Rubus caesius L.； fl avonoids； extraction and purifi cation； antioxidant activity

Q946.8

A

1002-6630（2015）14-0010-07

10.7506/spkx1002-6630-201514003

2014-12-23

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200259）；石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（RCZX2011011）

郭寒（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。E-mail：guohan525@126.com

何大俊（1980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。E-mail：hedajunww@163.com