王 君，周 潔，許迎科，王慷慨，王 菊，劉 涌，劉清君，王 平

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基于納米R(shí)uO的微型電化學(xué)胰島素傳感器

王 君1，周 潔1，許迎科1，王慷慨2，王 菊2，劉 涌2，劉清君1，王 平1

(1. 浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310027; 2. 浙江大學(xué)硅材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310027)

采用MEMS工藝及C-MEMS工藝制備碳微電極，在其上修飾納米氧化釕RuO顆粒后，表現(xiàn)出對(duì)胰島素的電催化氧化特性，可實(shí)現(xiàn)胰島素的電化學(xué)檢測(cè)。以此構(gòu)建的微型電化學(xué)胰島素傳感器，具有較好的電化學(xué)性能，其檢測(cè)靈敏度為1 nA/μM，檢測(cè)限為800 nM。該傳感器結(jié)合流動(dòng)注射分析系統(tǒng)，可獲得穩(wěn)定的測(cè)量，且所需樣品量少，易實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)、連續(xù)檢測(cè)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，也可構(gòu)建細(xì)胞傳感器，在胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的機(jī)理研究中具有良好的應(yīng)用前景。

碳微電極; 電化學(xué)生物傳感器; 胰島素檢測(cè); 納米金屬氧化物

胰島素是胰腺β細(xì)胞分泌的多肽類激素，具有調(diào)節(jié)碳水化合物和血糖水平的作用。胰島素也是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，通過檢測(cè)血清或血漿中胰島素含量，對(duì)臨床上糖尿病相關(guān)疾病的診斷非常有價(jià)值[1]。在過去十幾年，出現(xiàn)了許多胰島素檢測(cè)方法，如基于放射性免疫測(cè)定[2]、質(zhì)譜分析[3]、熒光光譜法[4]、表面等離子體共振技術(shù)[5]等。但這些方法或操作繁瑣、或靈敏度不高、或難以應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。隨著糖尿病患者人數(shù)的逐年增加，目前全球范圍內(nèi)患者人數(shù)已超過3.47億[6]人，因此，研究一種高靈敏度、價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)檢測(cè)胰島素的方法具有重要的意義。在眾多測(cè)試方法中，電化學(xué)技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快捷的特點(diǎn)，因而得到了極大的關(guān)注，包括電化學(xué)阻抗譜測(cè)試[7]和電流型檢測(cè)[8]兩種方式。前者將胰島素抗體固定在電極表面，通過電極阻抗的變化測(cè)試胰島素濃度，其檢測(cè)限可達(dá)到1.2 pM，但傳感器每測(cè)試一次需要采用甘氨酸鹽酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，不利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)量。

電流型檢測(cè)方法是給予電極一個(gè)特定的電壓，使得胰島素發(fā)生氧化，并產(chǎn)生氧化電流，通過電流與濃度的線性關(guān)系得出胰島素濃度信息。文獻(xiàn)[9]在玻碳電極上修飾一層含釕敏感膜(Ru-O/CN-Ru復(fù)合物)。后來的研究者對(duì)測(cè)試條件進(jìn)行了改進(jìn)，相繼在玻碳電極、碳纖維微電極和碳糊電極上成功地實(shí)現(xiàn)了胰島素的電化學(xué)檢測(cè)[10]，其敏感膜材料主要為基于釕或銥的化合物。

目前，胰島素的電化學(xué)檢測(cè)大多在傳統(tǒng)柱狀電極上進(jìn)行，而碳纖維微電極雖然尺寸微小，但其制備封裝較繁瑣，且難以保證不同電極之間的一致性。本文采用光刻膠熱解制備碳材料，構(gòu)建平面微電極陣列，在其上電化學(xué)修飾一層RuO納米顆粒，實(shí)現(xiàn)了胰島素電化學(xué)檢測(cè)的微型傳感器的設(shè)計(jì)，結(jié)合流動(dòng)注射分析系統(tǒng)，可對(duì)胰島素進(jìn)行穩(wěn)定、快速、連續(xù)的測(cè)量。

基于C-MEMS工藝制備的平面碳微電極，可為胰島素傳感器的構(gòu)建提供一種新的生物相容性及電化學(xué)性能優(yōu)良的電極材料，提高檢測(cè)電極的一致性，在傳感器的微型化、批量生產(chǎn)、降低成本等方面具有重要的意義，也為小型便攜式檢測(cè)器的研究提供可能。此外，碳微電極尺寸可根據(jù)不同檢測(cè)需要進(jìn)行靈活設(shè)計(jì)，將C-MEMS工藝與傳統(tǒng)MEMS工藝相結(jié)合，易于實(shí)現(xiàn)多參數(shù)、高通量檢測(cè)的微納集成芯片的研究，以及細(xì)胞水平的生物學(xué)研究，如胰島β細(xì)胞分泌胰島素的單細(xì)胞水平的實(shí)時(shí)檢測(cè)等。

1 胰島素電化學(xué)檢測(cè)原理

胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有兩條肽鏈，由51個(gè)氨基酸組成[11]，包括A鏈的21個(gè)氨基酸和B鏈的30個(gè)氨基酸，A、B兩條肽鏈直接通過胱/氨酸殘基的二硫鍵相連，如圖1所示，包含3個(gè)二硫鍵和4個(gè)酪氨酸殘基。此外，A鏈中有兩個(gè)半胱氨酸殘基橫跨5個(gè)肽鍵生成二硫鍵。胰島素分子的部分功能基團(tuán)具有電活性，其氧化還原活性位點(diǎn)通常為酪氨酸殘基的羥基和二硫鍵，但研究最多的是3個(gè)二硫鍵。其中A鏈中的二硫鍵暴露于三維結(jié)構(gòu)表面，已被證實(shí)具有電活性；一個(gè)二硫鍵部分被掩蓋，反應(yīng)較慢；第3個(gè)二硫鍵深埋于分子中，一般不參與反應(yīng)。而具有電化學(xué)活性的酪氨酸殘基通常深埋于三維結(jié)構(gòu)內(nèi)部構(gòu)成疏水中心，因此較難在電極表面進(jìn)行電化學(xué)氧化。利用A鏈中二硫鍵易被氧化的特性可實(shí)現(xiàn)胰島素的電流型檢測(cè)。如采用鎳粉修飾碳電極表面，利用高活性的氧化還原對(duì)Ni(OH)2/NiOOH，可實(shí)現(xiàn)pM級(jí)胰島素的檢測(cè)[12]，但測(cè)試需在堿性溶液中進(jìn)行。在生理pH條件下進(jìn)行胰島素檢測(cè)常用氧化釕進(jìn)行碳電極表面修飾，其工作電位在0.6～0.7 V之間，檢測(cè)限為20～50 nM，通過碳納米管改性，可將檢測(cè)限降低1個(gè)數(shù)量級(jí)，達(dá)到1 nM。

圖1 胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)

2 材料和方法

2.1 傳感器加工流程

傳感器采用碳微電極陣列的設(shè)計(jì)，由于碳電極具有較寬的電位窗口和較強(qiáng)的化學(xué)惰性，背景電流小，不易受溶液中氧氣的干擾等優(yōu)點(diǎn)，因此選用碳作為工作電極。采用標(biāo)準(zhǔn)微加工工藝MEMS和C-MEMS工藝[13]結(jié)合的方法進(jìn)行制備，如圖2a所示，以0.5 mm厚的透明石英玻璃作為基底。首先依次用丙酮、乙醇、去離子水對(duì)基片進(jìn)行超聲清洗20 min，然后在120 ℃烘箱內(nèi)20 min烘干。旋涂光刻膠時(shí)，分兩級(jí)轉(zhuǎn)速，先慢后快，第一級(jí)500 轉(zhuǎn)/min旋涂5 s，第二級(jí)3 000 轉(zhuǎn)/min旋涂60 s。熱解之前需對(duì)光刻膠進(jìn)行前烘，溫度90～110 ℃、時(shí)長(zhǎng)50～100 s，蒸發(fā)掉光刻膠內(nèi)的水分。然后采用光刻工藝制備出微電極雛形。

a. 碳微電極制備流程示意圖

b. 熱解碳膜實(shí)物 c. C-MEMS工藝制備的碳微電極

圖2 碳微電極制備工藝C-MEMS示意圖

熱解過程采用天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司生產(chǎn)的1 200 ℃開啟式真空氣氛管式電爐，真空度高達(dá)10?4～10?5Pa。熱解過程的升溫程序?yàn)?0～600 ℃之間，升溫速率5 ℃/min；600 ℃停留30 min，這時(shí)C-H鍵開始斷裂；600～1 000 ℃之間，升溫速率5 ℃/min；最后在1 000 ℃條件下保溫1 h，而后進(jìn)入自然退火過程，石英管中始終保持高真空環(huán)境。經(jīng)過慢速高溫退火之后，碳微電極形態(tài)保持完好，如圖2b、圖2c所示，制備的碳微電極直徑為20 μm。隨后采用SU-8光刻膠作為絕緣層，經(jīng)過一次光刻、顯影處理，可實(shí)現(xiàn)電極引線部分的覆蓋，而圓形工作電極及焊盤部分均暴露，以便后續(xù)的封裝測(cè)試等。

2.2 納米R(shí)uO的修飾

碳微電極本身對(duì)胰島素沒有氧化特性，可在其上修飾一層RuO納米顆粒，作為胰島素發(fā)生電催化氧化的催化劑。RuO的電鍍?cè)谌姌O系統(tǒng)中進(jìn)行(工作電極為碳電極，輔助電極為鉑，參比電極為Ag/AgCl)。所用試劑為三氯化釕(RuCl3)，無水，購于阿拉丁。清洗后的碳微電極浸泡于含有0.3 mM RuCl3的10 mM HClO4溶液中，在?0.85～0.65 V之間循環(huán)掃描12.5 min，速率10 V/s，在碳微電極表面即可形成一層RuO納米顆粒。為防止RuCl3發(fā)生氧化，電沉積需在RuCl3溶解于HClO4溶液中立即進(jìn)行處理。RuO制備完成后，將碳微電極浸泡在去離子水中備用。

2.3 胰島素檢測(cè)系統(tǒng)

將測(cè)試用胰島素(大于等于27 USP units/mg, sigma, I5523，來源于豬胰腺)溶解在0.01 M HCl溶液中得到1 mg/mL的母液，放置于?20 ℃冰箱中冷凍保存，測(cè)試前用含0.15 M NaCl的50 mM PBS溶液進(jìn)行稀釋。

圖3 胰島素測(cè)試系統(tǒng)示意圖

如圖3所示，測(cè)試過程采用流動(dòng)注射分析系統(tǒng)(flow injection analysis, FIA[14])，在分析技術(shù)中已被廣泛采用。采用FIA比手動(dòng)注射得到的結(jié)果更精確，適合低濃度樣品的穩(wěn)定測(cè)量。測(cè)試樣品與載體溶液通過電磁閥進(jìn)行自動(dòng)切換，形成一個(gè)測(cè)試樣品的擴(kuò)散帶進(jìn)入測(cè)試腔體。載體溶液采用含0.15 M NaCl的50 mM PBS溶液(pH為7)，流速為1 mL/min，每個(gè)樣品注射時(shí)間為10 s。傳感器芯片與待測(cè)液在密封的測(cè)試腔體進(jìn)行接觸，體積為100 μL。為避免流路系統(tǒng)中引入氣泡，溶液在進(jìn)入電磁閥之前需經(jīng)過除泡器去除氣泡。傳感器芯片封裝在PCB板上，結(jié)合輔助電極鉑，以及Ag/AgCl參比電極，通過電化學(xué)工作站CHI 660實(shí)現(xiàn)電化學(xué)測(cè)試。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 碳電極的特性

在實(shí)際應(yīng)用中正膠的使用更普遍，旋涂的膠膜相對(duì)負(fù)膠較薄，更適合用于制備碳電極，因此在制備碳膜時(shí)采用兩種正膠進(jìn)行比較：一種為蘇州瑞紅電子化學(xué)品有限公司的RZJ-304，膜厚范圍0.5～3 μm，分辨率1 μm；另一種為美國Hoechst公司的AZ5214，分辨率0.5 μm。光刻膠熱解之后的測(cè)試結(jié)果如表1所示。

表1 光刻膠熱解碳膜的電學(xué)參數(shù)

由于采用的熱解條件相同，兩種正膠的膜厚和收縮率是接近的，電阻率與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的3～6×10?3Ω×cm在同一數(shù)量級(jí)但數(shù)值更低，說明本研究制備的碳膜導(dǎo)電性更好。

碳膜電極可采用Fe(CN)63/4?為測(cè)試對(duì)子進(jìn)行電化學(xué)方法表征。以鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl為參比，兩種碳膜電極的循環(huán)伏安測(cè)試結(jié)果如圖4所示，并采用CHI玻碳電極的測(cè)試結(jié)果作為對(duì)照。圖中，峰電流由小到大對(duì)應(yīng)的掃描速率為10、20、50、100、200 mV/s，背景電解質(zhì)0.1 M H2SO4。由于單個(gè)碳微電極產(chǎn)生的電信號(hào)較小，測(cè)試時(shí)將64電極進(jìn)行并聯(lián)。每條CV曲線的峰電位差值及峰電流如表2所示。

表2 碳電極CV曲線的峰電位及峰電流

a. CHI玻碳電極

b. RZJ-304光刻膠

c. AZ5214光刻膠

d. 碳微電極

圖4 碳電極在1 mM K3Fe(CN)6溶液中不同掃描速率下測(cè)試的循環(huán)伏安曲線

Fe(CN)63/4?之間為單電子反應(yīng)，理論上峰電位之差Δp應(yīng)為59 mV。玻碳電極與理論情況一致，掃描速率對(duì)其影響不大。但對(duì)于熱解的碳電極，峰電位差Δp略高于理論值，并且隨著掃描速率的增加而增大，說明碳膜表面可能由于某些基團(tuán)的物質(zhì)吸附作用，導(dǎo)致電子傳遞受阻，使得電極的可逆性降低。此外，氧化與還原峰電流之比p,a/p,c近似等于1，說明發(fā)生在電極表面的反應(yīng)為可逆電對(duì)，這符合Fe(CN)63/4?在玻碳電極表面的電化學(xué)特性。峰電流若與掃描速率的平方根成正比說明反應(yīng)受擴(kuò)散控制。結(jié)果顯示，玻碳電極、RZJ-304、AZ5214碳膜電極、AZ5214碳微電極測(cè)試的峰電流與掃描速率的平方根之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、0.998 1、0.997 8、0.995 9，說明電極表面的反應(yīng)受到擴(kuò)散控制，即Fe(CN)63/4?在電極表面的電化學(xué)反應(yīng)速率非?？??？偟膩碚f，光刻膠熱解碳電極的電化學(xué)性能雖然稍遜色于玻碳電極，但在較低掃描速率下(<20 mV/s)能滿足電化學(xué)測(cè)試要求。AZ5214熱解碳的電化學(xué)性能稍微優(yōu)于RZJ-304。

3.2 納米R(shí)uO表征

圖5a為碳微電極電沉積RuO納米之后的掃描電鏡照片，可以看出RuO納米顆粒尺寸均一，在碳電極表面分布均勻，其粒徑在幾十至一百納米之間。

a. RuOSEM照片(放大15 000倍)

b. 胰島素和空白溶液的循環(huán)伏安曲線對(duì)比

c. 3種不同胰島素濃度的電流-時(shí)間曲線(電壓0.7 V)

對(duì)其進(jìn)行循環(huán)伏安曲線掃描，測(cè)試RuO顆粒的有效性，結(jié)果如圖5b所示。在+0.7 V處，胰島素出現(xiàn)氧化峰電流響應(yīng)，而在載體溶液中，電極沒有出現(xiàn)氧化峰電流響應(yīng)，說明胰島素在0.7 V電壓下發(fā)生電催化氧化。采用FIA系統(tǒng)，在固定0.7 V電壓下測(cè)試3種不同濃度胰島素的電流-時(shí)間曲線，結(jié)果顯示胰島素濃度越高，得到的電流峰幅度越大。碳電極表面的RuO顆粒在一定極化電壓條件下對(duì)胰島素具有敏感響應(yīng)特性，并且對(duì)不同胰島素濃度溶液具有較好的區(qū)分效果。

3.3 胰島素檢測(cè)結(jié)果

圖6所示為胰島素和載體溶液交替注射進(jìn)入測(cè)試腔體的氧化電流響應(yīng)，固定電壓為0.7 V，背景溶液為含0.15 M NaCL的50 mM PBSI溶液。測(cè)試信號(hào)對(duì)胰島素有較大的依賴，峰值隨胰島素濃度成比例增加，二者之間高度線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為0.997 5)，其響應(yīng)靈敏度約為1 nA/μM，檢測(cè)下限為800 nM。

a. 不同胰島素濃度的響應(yīng)電流

b. 胰島素響應(yīng)電流與濃度的線性擬合曲線

圖6 胰島素測(cè)試結(jié)果

4 結(jié)束語

本文利用C-MEMS工藝技術(shù)制備碳微電極，構(gòu)建了微型電化學(xué)檢測(cè)傳感器。在高真空環(huán)境下高溫?zé)峤庵苽涞奶嘉㈦姌O具有較好的電化學(xué)性能，在修飾RuO納米顆粒后，可將胰島素在電極表面進(jìn)行電催化氧化，從而實(shí)現(xiàn)胰島素的直接電化學(xué)檢測(cè)。其檢測(cè)靈敏度為1 nA/μM，檢測(cè)限為800 nM。電化學(xué)檢測(cè)具有響應(yīng)快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合流動(dòng)注射分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)低濃度胰島素的穩(wěn)定測(cè)量。

本文獲得的胰島素檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)限在一定程度上遜色于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果，說明碳微電極的制備工藝和表面修飾方法有待進(jìn)一步改進(jìn)。但本文為微型化胰島素傳感器的研究提供了一個(gè)有效的方法，結(jié)合微細(xì)加工技術(shù)，大大增強(qiáng)了傳感器設(shè)計(jì)的靈活性，在少樣品檢測(cè)方面具有較大的發(fā)展前景。若將電極尺寸設(shè)計(jì)成與細(xì)胞相當(dāng)，有望開發(fā)出新型的細(xì)胞傳感器，并將其應(yīng)用于單個(gè)胰腺β細(xì)胞分泌胰島素的機(jī)理研究。

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編 輯 黃 莘

Micro-Fabricated Electrochemical Insulin Sensor Modified with RuONano Particles

WANG Jun1, ZHOU Jie1, XU Ying-ke1, WANG Kang-kai2, WANG Jü2, LIU Yong2, LIU Qing-jun1, and WANG Ping1

(1. Biosensor National Special Lab, Zhejiang University Hangzhou 310027; 2. State Key Lab of Silicon Materials, Zhejiang University Hangzhou 310027)

Insulin detection is significant in clinical study, but the lack of effective detection methods impedes its clinical applications. In this work, the carbon microelectrode fabricated with MEMS (micro-electromechanical system) and C-MEMS (complex micro-electromechanical system) technology is applied for insulin detection. The carbon microelectrodes were fabricated through the pyrolysis of photoresist and showed good electrochemical performance. After electro-deposition of ruthinium oxide nano particles on the electrode surface, the insulin oxidation is electro-catalyzed and its electrochemical detection is realized at 0.7 V. The sensor has a sensitivity of 1 nA/μM for insulin detection, with a detection limit of 800 nM. Electrochemical measurement shows that the sensor has advantages of high sensitivity, fast response and usability for real time on-site detection.

carbon microelectrodes; electrochemical biosensor; insulin detection; nanostructured metal-oxides

TH77

A

10.3969/j.issn.1001-0548.2015.01.027

2013-12-10；

2014-09-22

國家自然科學(xué)基金(61320106002)；中國博士后基金(2014M561764)；浙江省博士后科研項(xiàng)目擇優(yōu)資助(BSH1402030)

王君(1985-)，女，博士，主要從事電化學(xué)生物傳感器方面的研究.