劉 申，趙雪峰

(大連大學附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

論 著

Claudin-7基因敲減細胞對裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用

劉 申，趙雪峰

(大連大學附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連 116021)

目的 研究Claudin-7基因敲減細胞對裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用。方法 采用Claudin-7基因敲減表達質粒和pcDNA6-Scramble空載質粒轉染的人胰腺癌細胞BxPC-3建立裸鼠原位移植胰腺癌模型，裸鼠隨機分為兩組，即Claudin-7敲減組和陰性對照組。制模30 d后比較兩組間成瘤情況，并采用病理學方法檢測兩組腫瘤細胞生長程度。結果 Claudin-7敲減組成瘤率和大體觀腫瘤大小測量值明顯高于對照組，兩組間差異有顯著性意義(P<0.05)。胰腺腫瘤組織的病理學檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞生成率和腫瘤最大直徑兩組間差異有顯著性意義(P<0.05)。結論 Claudin-7基因敲減能有效促進裸鼠原位移植胰腺癌模型的形成。

Claudin-7敲減；裸鼠；原位移植；胰腺癌

Claudin-7蛋白是構成緊密連接的重要成分，是影響緊密連接功能的關鍵蛋白之一。目前多數(shù)學者主張Claudin-7是潛在的抑癌基因[1]。近年來，Claudin-7對諸多原發(fā)癌抑制作用的研究非常活躍，但對于胰腺癌的研究報道極少[2]。本實驗擬采用Claudin-7基因敲減表達質粒和pcDNA6-Scramble空載質粒轉染的人胰腺癌細胞BxPC-3建立裸鼠原位移植胰腺癌模型，以觀察研究Claudin-7基因敲減細胞對胰腺的致癌作用及其前臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與材料

人胰腺癌細胞株BxPC-3 (Claudin-7基因敲減表達質粒轉染組和pcDNA6-Scramble空載體質粒轉染組) 由韓國CNU腫瘤研究所Young-Kyu Park教授捐贈。BAL b/c品系裸鼠20只，7周齡雌性，體重18～20 g，由韓國CNU實驗動物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及懸液制備：兩組人胰腺癌細胞株BxPC-3分別在攝氏37 ℃、5%CO2，含10%血清RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2～3 d換1次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至80%～90%融合時，用0.25%胰酶消化液消化后，1200 r/min離心3 min，棄上清液，加無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗細胞2次，顯微鏡下計數(shù)，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×107/mL。制備好的RPMI 1640和Matrigel (3∶1) 細胞懸液置于冰浴保存，待30 min內進行接種。

1.2.2 動物模型設計：制模前1周為實驗動物安定期，防止進行對裸鼠的一切刺激性操作。實驗動物共20只，隨機分兩組，分別為10只Claudin-7敲減組和10只對照組。

1.2.3 放大鏡輔助下原位移植胰腺癌模型的建立：根據(jù)麻醉預實驗結果，選擇異氟醚進行全身麻醉。放大鏡輔助下(Binocular lens， Heine， Germany)取上腹正中切口長約5mm，逐層入腹后小心牽拉大網(wǎng)膜并顯露脾臟。在脾臟臟面尋找胰腺體尾部，采用31號針頭在胰腺體尾部迷路進針約2 mm，緩慢注入BxPC-3人胰腺癌細胞懸液2×106/100 μL至胰腺被膜下，見注射部位胰腺被膜呈球狀隆起，并在其內可見黃白色胰腺組織，拔針時用止血小紗布輕輕按壓10 s后，關腹。建立模型全程應防止脾臟、胃及主要血管的損傷，也要防止注射部位腫瘤細胞的滲漏。

1.2.4 觀察裸鼠指標：每天常規(guī)觀察記錄裸鼠狀態(tài)，包括飲食、活動量、皮膚狀態(tài)、排泄物觀察期滿30 d予以處死。裸鼠如出現(xiàn)頻死前癥狀，應人道處死。處死后立即解剖觀察腹腔內成瘤情況，具體記錄胰腺腫瘤大小、淋巴結轉移、血性腹水、腹膜種植轉移及遠處轉移情況。所有胰腺病灶取出后充分固定在4%多聚甲醛中，行病理學檢查證實。病理學檢測首先觀察大體的腫瘤形成率。胰腺包塊假瘤在顯微鏡下觀測中未見腫瘤細胞，考慮因部分腫瘤細胞注射到胰腺組織后轉歸為凋亡、無法著床、被排斥、炎性介導或形成廢用性瘢痕。采取連續(xù)切片的方法來確定腫瘤最大直徑。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，組間比較采用Student’s t-test和卡方檢驗進行統(tǒng)計分析， 認為P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 成瘤情況

肉眼觀察，兩組無淋巴結轉移、血性腹水及腹膜種植轉移，見圖1。Claudin-7敲減組成瘤率和大體觀腫瘤大小與對照組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。

2.2 成瘤組織的病理學觀察

胰腺腫瘤組織的病理學檢測中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞生成率和腫瘤最大直徑兩組間差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，成瘤癌細胞為片狀及巢狀排列，形態(tài)呈橢圓形或不規(guī)則形，細胞分化程度低，核大，深染，核質比大，浸潤性生長，其對照組腫瘤細胞生長相對局限，中央出現(xiàn)壞死區(qū)，見圖2。

圖1 Claudin-7敲減組和對照組的成瘤情況

表1 裸鼠原位移植胰腺癌模型的大體觀和顯微鏡下觀比較

3 討 論

緊密連接蛋白家族的主要成員有Claudins、Occludins及連接支持分子。其中Claudins是形成緊密連接的跨膜糖蛋白，也是緊密連接結構及功能的重要組成成分。在正常生理環(huán)境中，細胞間的緊密連接扮演著構建和維護細胞的極性和屏障機能，一旦緊密連接被破壞可引發(fā)腫瘤單個細胞的脫落、粘附、降解及移動[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Claudins在不同組織顯示了截然不同的表達模式，其中Claudin-7在多種上皮來源的原發(fā)癌組織中，由于基因啟動子被甲基化而導致表達明顯下調，其基因的低表達增加了如結直腸癌等上皮來源腫瘤的浸潤和轉移能力[4]。因此，Claudin-7被認為是潛在的腫瘤抑制劑。此外，Claudin-7的表達與腫瘤患者的預后有關，Claudin-7的高表達明顯提高腫瘤患者的生存率，并且Claudin-7的表達水平及臨床分期是腫瘤患者預后的獨立預測因素[5]。

圖2 顯微鏡下Claudin-7敲減組和對照組的胰腺腫瘤組織情況

目前原位移植胰腺癌模型通常采用兩種方法：(1)皮下種植的瘤塊埋植到胰腺被膜外；(2)癌細胞注入到胰腺被膜下。經研究得出兩種方法的成瘤率，前者成瘤率為100%，而后者成瘤率卻為33%～100%[6]。本研究組曾嘗試過先將人胰腺癌細胞接種到裸鼠皮下，待其成瘤后，再將皮下瘤塊經無菌條件下取出，原位種植到裸鼠胰腺體尾部。其方法雖胰腺成模確切，但對其前臨床觀察和抗腫瘤藥物篩選模型的制作有諸多阻礙。直接將人胰腺癌細胞注入到胰腺被膜下的原位移植胰腺癌模型的缺點為：(1)成瘤率低；(2)癌細胞沿注射針眼外溢而發(fā)生腹膜種植轉移。為彌補這些缺點有人研發(fā)了微囊化人胰腺癌細胞建立胰腺癌模型方法，但其操作方法相對復雜[7]。本研究組全麻下將RPMI 1640和Matrigel (3∶1) 癌細胞懸液直接注入裸鼠胰腺制作原位移植胰腺癌模型，判斷其模型可否值得前臨床推廣。此模型的優(yōu)勢在于：(1)癌細胞游動空間局限而成模穩(wěn)定，也可防止術中、術后滲漏；(2)未采用腹腔內麻醉，使得癌細胞在腹腔內臟器的成活率倍增，加上操作完成后裸鼠方可立即活動，增加了癌細胞在腹腔內臟器的粘附和侵襲；(3)操作簡便易行，且成瘤率高，能滿足量化實驗，值得前臨床推廣應用。值得強調的是，由于裸鼠自身胰腺解剖特點的制約，裸鼠原位移植胰腺癌模型是對注射部位要求較高的動物實驗，應精準操作，同時配備放大鏡或直筒顯微鏡。

本研究結果顯示，Claudin-7敲減組能有效促進裸鼠原位移植胰腺癌模型的形成。兩組模型解剖觀察，發(fā)現(xiàn)兩組模型均無淋巴結轉移、血性腹水及腹膜種植轉移，Claudin-7敲減組腫瘤生長相對迅猛，對照組腫瘤生長相對緩慢。Claudin-7敲減組肉眼觀察成瘤率為90%，而顯微鏡下觀察卻發(fā)現(xiàn)成瘤率為100%。對照組肉眼觀察成瘤率為30%，但顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)成瘤率為50%。兩組模型腫瘤大小差異顯著。

綜上所述，Matrigel癌細胞懸液直接注入裸鼠胰腺制作原位移植胰腺癌模型，操作簡便、安全、可靠、有效并值得前臨床推廣應用。Claudin-7基因敲減可促進裸鼠胰腺癌的形成，但Claudin-7能否作為胰腺癌診斷標記物及治療靶點有待于進一步證實。

特此，感謝韓國Young Kyu Park教授的捐贈。

[1] Alikanoglu AS, Gunduz S, Demirpence O, et al. Expression pattern and prognostic significance of claudin 1, 4and 7 in pancreatic cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2015， 16(10): 4387-4392.

[2] Thuma F, Z?ller M. EpCAM-associated claudin-7 supports lymphatic spread and drug resistance in rat pancreatic cancer[J]. Int J Cancer， 2013， 133(4): 855-866.

[3] Iravani O, Tay BW, Chua PJ, et al. Claudins and gastric carcinogenesis[J]. Exp Biol Med(Maywood), 2013， 238(4): 344-349.

[4] Krause G, Winkler L, Mueller SL, et al. Structure and function of claudins[J]. Biochim Biophys Acta, 2008， 1778(3): 631-645.

[5] Jun KH, Kim JH, Jung JH, et al. Expression of claudin-7 and loss of claudin-18 correlate with poor prognosis in gastric cancer[J]. Int J Surg, 2014， 12(2): 156-162.

[6] Hotz HG, Reber HA, Hotz B, et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer[J]. Pancreas, 2003， 26(4): e89-98.

[7] Bisht S, Mizuma M, Feldmann G, et al. Systemic administration of polymeric nanoparticle-encapsulated curcumin(NanoCurc) blocks tumor growth and metastases in preclinical models of pancreatic cancer[J]. Mol Cancer Ther， 2010， 9(8): 2255-2264.

Carcinogenic effects of Claudin-7 gene knockdown on the pancreatic cancer nude mice model by orthotopic implantation

LIU Shen, ZHAO Xue-feng

(DepartmentofGeneralSurgery,DalianUniversityAffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

Objective To study the carcinogenic effects of Claudin-7 gene knockdown on the pancreatic cancer nude mice model by orthotopic implantation. Methods BxPC-3 pancreatic cancer cells transfected by recombinant clone vector plasmid-mediated Claudin-7 gene knockdown and blank vector pcDNA6-Scramble were used to establish the pancreatic cancer mice model by orthotopic implantation. The tumor bearing nude mice were randomized into 2 groups, Claudin-7 knockdown group and control group. After 30 days of the pancreatic injection, the pancreatic tumor formation was evaluated in two groups. The tumor cell growth in pancreatic tumor tissues were investigated by pathological detection. Results The tumor formation rate and tumor size of Claudin-7 knockdown group were significantly greater than that in the control group (P<0.05) by gross and microscopic examination. Conclusion Claudin-7 knockdown could have a stimulative effect on the tumor formation in pancreatic cancer nude mice model by orthotopic implantation.

Claudin-7 knockdown; nude mice; orthotopic implantation; pancreatic cancer

10.11724/jdmu.2015.06.09

劉 申(1978-)，女，遼寧朝陽人，主治醫(yī)師。

趙雪峰，博士后，副主任醫(yī)師。E-mail： zhaoxuefeng74@hanmail.net

R34

A

1671-7295(2015)06-0556-04

劉申，趙雪峰. Claudin-7基因敲減細胞對裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用[J].大連醫(yī)科大學學報，2015,37(6)：556-559.

2015-06-21；

2015-11-12)