趙健，胡桂學(xué)?，董浩，張雙，邵洪澤，王開(kāi)，趙艷麗

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130062）

鵝卵黃抗體IgY的提純及其酶標(biāo)抗體的制備

趙健1，胡桂學(xué)1?，董浩1，張雙1，邵洪澤2，王開(kāi)1，趙艷麗1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長(zhǎng)春130062）

本試驗(yàn)采用辛酸去脂、飽和硫酸銨溶液鹽析法提純鵝卵黃抗體IgY，采用SDS-PAGE方法分析其純度；用純化后的IgY免疫試驗(yàn)兔，收集血清，測(cè)定血清抗體效價(jià)；采用辛酸-硫酸銨法結(jié)合Protein G樹(shù)脂親和層析法純化兔血清IgG，用改良的高碘酸鈉法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，直接ELISA法測(cè)定標(biāo)記物效價(jià)。結(jié)果表明，提純的鵝卵黃IgY濃度為11.5 mg/mL，純度約為92%；血清瓊脂擴(kuò)散抗體效價(jià)為1∶32；Western Blotting試驗(yàn)證明，兔血清中含有抗鵝卵黃抗體IgY重鏈及輕鏈的特異性抗體；直接ELISA法測(cè)得標(biāo)記物效價(jià)為1∶1 100。

鵝；卵黃IgY；提純；酶標(biāo)抗體

酶標(biāo)抗體是指抗體單體分子通過(guò)共價(jià)鍵與酶分子聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物，它既具備抗體的免疫特異性，又具有酶的高效催化性。酶標(biāo)抗體的發(fā)明與應(yīng)用派生了抗體原位雜交反應(yīng)及液相免疫吸附等試驗(yàn)方法，給抗原或抗體的檢測(cè)提供了極大的方便，尤其是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immune sorbent as-say，ELISA）方法特異性強(qiáng)、敏感性高、過(guò)程簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被人們所認(rèn)可[1]。酶標(biāo)抗體作為ELISA中的重要組成部分，是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。目前，市面上已經(jīng)有多種動(dòng)物的酶標(biāo)抗體，但國(guó)內(nèi)外尚未出現(xiàn)商品化的抗鵝IgY的酶標(biāo)抗體。在鵝卵中又含有豐富的與血清抗體相一致的卵黃抗體IgY[2]，并且其含量超過(guò)血清中的含量[3]。從卵黃中提取IgY的方法有很多種，很多學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了相關(guān)研究[4]。本試驗(yàn)參考雞卵黃抗體純化方法提純鵝卵黃抗體IgY，應(yīng)用改良的高碘酸鈉法進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）的標(biāo)記，制備了兔抗鵝IgY酶標(biāo)抗體，為鵝傳染病的診斷方法研究提供了材料。

1 材料與方法

1.1 材料鵝卵由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鵝場(chǎng)提供，新西蘭大白兔購(gòu)自長(zhǎng)春實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑：高碘酸鈉、硼氫化鈉購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；硫酸銨購(gòu)自北京化工廠；正辛酸購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、山羊抗兔酶標(biāo)二抗購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鵝卵黃抗體IgY的提取打開(kāi)鵝卵，將鵝卵黃與蛋清進(jìn)行分離，去除蛋清。用注射器刺破卵黃膜吸取一定體積卵黃原液于燒杯中，加入8倍體積的雙蒸水，攪拌混勻。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至5.3，靜置2 h。7 000 r/min離心20 min，上清用雙層濾紙過(guò)濾，在濾過(guò)液中加入正辛酸使其終濃度為10 mL/L，攪拌20 min，靜置20 min，7 000 r/min離心20 min；抽取第3層上清液，經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾后即為IgY初提液。

1.2.2 鵝卵黃抗體IgY的純化取一定量的IgY初提液于燒杯中，緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌。置于4℃冰箱鹽析過(guò)夜。5 000 r/min離心10 min，棄去上清；用PBS溶液重新溶解沉淀至初體積，緩慢加入一半初體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，靜置1 h；再次離心棄上清，用PBS溶液重新溶解沉淀至初體積，如此反復(fù)洗滌3次；最后用適量PBS溶解，將溶解液裝入截留分子質(zhì)量為50 KDa的透析袋中，以100倍體積PBS透析過(guò)夜，期間更換3次透析液。12 000 r/min離心10 min，上清即為鵝卵黃抗體IgY，分裝后置于-80℃保存。

1.2.3 鵝卵黃抗體IgY濃度的測(cè)定按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行IgY濃度測(cè)定。用酶標(biāo)儀測(cè)得OD562nm值，以O(shè)D562nm值為縱坐標(biāo)，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，進(jìn)而得出IgY蛋白濃度。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析將IgY蛋白液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，與適當(dāng)體積的4×SDS Protein Buffer混合，沸水水浴8 min后冷卻備用。按照配方配制15%分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣20 μL，廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker 5 μL。采用80 V 20 min、120 V 100 min進(jìn)行間歇電泳。凝膠經(jīng)G-250染色1 h，脫色后觀察。

1.2.5 動(dòng)物免疫背部皮下多點(diǎn)注射免疫試驗(yàn)兔，每隔2周進(jìn)行1次。第一次免疫0.5 mL IgY（1.00 mg蛋白）和0.5 mL弗氏完全佐劑的乳化物；第二次用弗氏不完全佐劑和IgY進(jìn)行乳化，劑量和方法同上；第三、四次直接用2 mL純化的IgY（含1.00 mg蛋白）在背部皮下多點(diǎn)注射；第五次通過(guò)耳靜脈注射0.80 mg IgY；末次免疫后10 d，頸動(dòng)脈采血，收集血清。

1.2.6 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)用免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)兔抗鵝IgY血清的瓊脂擴(kuò)散效價(jià)。按2倍稀釋法配制成不同稀釋度的兔血清，依次加入到外周孔中。中間加入鵝卵黃抗體IgY。37℃濕盒中放置24 h后觀察沉淀線。

1.2.7 Western Blotting試驗(yàn)將純化得到的IgY與適量4×SDS Protein Buffer混合后煮沸10 min，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，加入蛋白廣譜彩虹Marker。120 V進(jìn)行電泳。利用Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電流為200 mA電泳60 min；轉(zhuǎn)膜完畢后，TBST洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液，放入5%脫脂奶粉的封閉液中，4℃封閉過(guò)夜；加入稀釋好的一抗（兔抗鵝IgY抗血清），4℃孵育6 h；棄去一抗，TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；將PVDF膜加入稀釋好的山羊抗兔酶標(biāo)二抗中，室溫緩慢孵育1 h，棄去二抗，TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min；使用Western發(fā)光檢測(cè)試劑ECL滴于PVDF膜上，在暗室中將膠片壓在PVDF膜上，蓋上暗盒作用30～90 s，膠片放于顯影液中顯影，再放于定影液中定影，然后拍照。

1.2.8 兔血清IgG的初步提純將血清與5倍體積pH為5.0醋酸緩沖液混合，加入正辛酸使其終濃度為10 mL/L，室溫?cái)嚢?0 min后4℃靜置2 h，8 000 r/min離心10 min。上清經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾后即為IgG初提液。將等體的積飽和硫酸銨溶液緩慢加入到裝有IgG初提液的燒杯中，邊加邊攪拌。將燒杯置于4℃冰箱中鹽析2 h，8 000 r/min離心10 min，棄去上清；用PBS重新溶解沉淀至初體積，緩慢加入一半初體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，靜置1 h；再次離心棄上清，用PBS重新溶解沉淀至初體積，反復(fù)洗滌3次；最后用適量PBS溶解并裝入到截留分子質(zhì)量為50 KDa的透析袋中，以100倍體積PBS透析過(guò)夜，期間更換3次透析液，用奈氏試劑檢測(cè)合格后分裝保存在-20℃冰箱內(nèi)。即為兔血清IgG初純液。

1.2.9 兔IgG過(guò)柱純化將Protein G Resin灌入到柱管中，用20 mL PBS洗去樹(shù)脂中的乙醇并平衡樹(shù)脂；將兔血清IgG初純液從冰箱中取出，經(jīng)12 000 r/min離心10 min后吸取上清加入到柱管中，控制流速在1 mL/min左右，待全部流出后加入0.01 mol/L PBS進(jìn)行洗滌去除雜蛋白，用量約為30 mL。流凈后逐次加入1 mL Elution Buffer（50 mM Tris-HCl 10 mM Reduced Glutathione，pH=8.0）進(jìn)行洗脫，收集每次流出的洗脫液進(jìn)行SDSPAGE分析后，用0.01 M pH 9.5的碳酸鹽緩沖液通過(guò)濃縮管離心洗滌并濃縮目的蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定其濃度。方法如1.2.3所述。

1.2.10 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記稱取10 mg HRP溶解于2 mL蒸餾水中。加入0.4 mL新配的0.1 M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20 min。將上述溶液裝入蛋白濃縮管中，用1mM pH 4.4的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行洗滌，并恢復(fù)原體積。加入0.2 M pH 9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入2 mL IgG（含20 mg IgG），室溫避光輕輕攪拌2 h。加入0.4 mL新配的4 mg/mL NaBH4液，混勻，4℃靜置2 h。將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15 M pH 7.4 PBS透析，4℃過(guò)夜。將透析后液體在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1 h。3 000 r/min離心30 min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗2次，最后沉淀物溶于少量0.15 M pH 7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，用0.15 M pH 7.4的PBS緩沖溶液透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測(cè)），10 000 r/min離心30 min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入無(wú)菌甘油至40%，分裝后，-20℃凍保存。

1.2.11 酶標(biāo)抗體使用稀釋倍數(shù)的測(cè)定將鵝卵黃IgY用碳酸鹽包被液稀釋至10 μg/mL，加入到酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4℃包被過(guò)夜，5%脫脂乳37℃封閉2 h，PBST洗滌3次，200 μL/次，5 min/次，將酶標(biāo)抗體用5%脫脂乳進(jìn)行100、200、400、800、1 600倍稀釋，并設(shè)置2組平行，每孔100 μL 37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，每次200 μL/5 min，拍干后加入100 μL TMB底物顯色液，37℃顯色15 min后加入50 μL硫酸終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm處進(jìn)行讀數(shù)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)繪制滴定曲線，通過(guò)曲線方程得出OD值為1.0時(shí)的稀釋倍數(shù)為酶標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝卵黃IgY SDS-PAGE分析及濃度測(cè)定Grey等[5]相關(guān)研究結(jié)論表明，鵝和鴨在免疫球蛋白方面同它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)生學(xué)上有很高的親源性一樣，有著很高的相似性。鴨的IgY重鏈大小為62～67 KDa，輕鏈大小為22～25 KDa。本試驗(yàn)用SDS-PAGE分析經(jīng)辛酸-硫酸銨方法純化得到的鵝卵黃IgY，出現(xiàn)純度比較高的2條特異性條帶，分子質(zhì)量大小約為66 KDa和27 KDa，見(jiàn)圖1，經(jīng)Quantity One軟件分析，結(jié)果表明IgY純度為92%。采用BCA蛋白試劑盒方法測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，測(cè)定樣品（IgY10倍稀釋液）吸光值為1.195，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到IgY原液濃度為11.5 mg/mL。

2.2 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果將倍比稀釋的兔抗鵝血清及鵝卵黃IgY加入瓊脂梅花孔中進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散，24 h后觀察到在兔抗鵝血清與鵝卵黃IgY之間出現(xiàn)了清晰的沉淀線（如圖2），結(jié)果顯示兔抗鵝血清IgG效價(jià)為25，達(dá)到了制備酶標(biāo)抗體的要求。

圖1 鵝卵黃IgY純化后SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analyses of the purified goose yolk IgY

圖2 BSA的蛋白濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of protein concentrationabsorbance of BSA

圖3 兔血清瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)Fig.3 Ager diffusion reaction of the rabbit-anti-goose IgG in ager gel

2.3 Western Blotting將純化后的IgY進(jìn)行SDSPAGE電泳，采用濕式轉(zhuǎn)移法將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并以兔抗鵝IgY的抗血清作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行免疫印記試驗(yàn)。如圖4所示，出現(xiàn)兩條特異性的印記條帶，證明兔抗鵝IgY血清中產(chǎn)生了抗IgY輕（L鏈）、重鏈（H鏈）的特異性抗體，并具有生物活性，能夠特異性的結(jié)合IgY，符合制備酶標(biāo)抗體特異性要求。

圖4 免疫印記結(jié)果Fig.4 The resylt of western blotting

2.4 兔抗鵝IgG的純化結(jié)果以辛酸-硫酸銨法初提IgG，再通過(guò)Protein G Resin純化，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，如圖3所示出現(xiàn)2條特異性條帶，大小約為57 KDa和26 KDa，經(jīng)蛋白濃縮管濃縮后測(cè)得兔抗鵝IgG濃度為12 mg/mL。

2.5 酶標(biāo)抗體稀釋度確定結(jié)果采用直接ELISA方法包被鵝卵黃IgY，每孔1 μg/100 μL，用5%脫脂乳將酶標(biāo)抗體稀釋成不同稀釋度，并設(shè)置2組平行，測(cè)得OD450nm值，通過(guò)曲線方程計(jì)算得到在OD450nm為1.0時(shí)酶標(biāo)抗體的稀釋度為1 100。

3 結(jié)論與討論

卵黃中除大量免疫球蛋白之外，還有很多雜質(zhì)，包括脂類、非免疫蛋白等[6]。其中IgY是水溶性γ球蛋白。李冰等[7]采用水稀釋結(jié)合硫酸銨鹽析法，成功獲得雞源抗豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體，應(yīng)用到防治仔豬流行性腹瀉病上，并提高40%的成活率。證明用水進(jìn)行溶解后以硫酸銨鹽析沉淀的方法提取卵黃抗體是可行的。本實(shí)驗(yàn)采用水稀釋法結(jié)合辛酸去脂，硫酸銨鹽析沉淀的方法進(jìn)行鵝卵黃IgY的提取與純化，得到了較純的鵝卵黃抗體IgY，經(jīng)過(guò)濃度測(cè)定達(dá)到11.5 mg/mL。

圖5 兔抗鵝IgG純化后SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analyses of the rabbit-anti-goose IgG

圖6 酶標(biāo)抗體滴定曲線Fig.6 The titration curve of Enzyme labelled antibody

隨著鵝產(chǎn)品逐漸走上人們的餐桌，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，鵝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，也促進(jìn)了學(xué)者對(duì)鵝類疾病相關(guān)研究。而鵝卵黃抗體以其獲得方便、效果顯著、安全等優(yōu)勢(shì)逐漸被重視。劉菲等[8]以GPV滅活疫苗免疫種鵝，從鵝卵中成功提取了抗GPV的卵黃抗體。本試驗(yàn)獲得的鵝卵黃抗體IgY通過(guò)SDS-PAGE分析表明，其重鏈大小約為66 Kda，輕鏈大小約為27 KDa，與劉菲得到的卵黃抗體大小一致，這證明本試驗(yàn)得到的確實(shí)為鵝IgY。

機(jī)體對(duì)外來(lái)抗原物質(zhì)能夠進(jìn)行識(shí)別進(jìn)而產(chǎn)生能夠與之結(jié)合的特異性抗體，而產(chǎn)生的抗體種類則由抗原自身的抗原決定簇決定的[9]。鳥(niǎo)類卵黃抗體IgY分為H鏈和L鏈，都能誘導(dǎo)兔子產(chǎn)生特異性抗體。林樹(shù)柱等[10]制備了十六種鳥(niǎo)類的酶標(biāo)二抗，通過(guò)Western Blotting證實(shí)其制備的酶標(biāo)二抗能與其抗原輕鏈和重鏈作用。故本試驗(yàn)以鵝IgY為目的蛋白，以兔抗鵝IgY血清為一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行蛋白免疫印記試驗(yàn)，獲得了兩條特異性條帶，也證明了兔機(jī)體產(chǎn)生了抗鵝IgY H鏈及L鏈的抗體。用抗鵝IgY血清提純兔IgG制備酶標(biāo)二抗能夠特異性的與鵝血清中抗體結(jié)合，給未來(lái)研究鵝傳染病抗體檢測(cè)提供了一個(gè)有力的工具。而酶標(biāo)抗體作為ELISA檢測(cè)試劑的重要組成部分，在免疫學(xué)診斷中發(fā)揮重要作用，本研究制備的兔抗鵝IgY酶標(biāo)抗體為鵝相關(guān)疫病的免疫學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)。

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Extraction and purification of IgY from goose egg yolk and preparation of rabbit anti-goose IgG labeled by HRP

Zhao Jian1,Hu GuiXue1*,Dong Hao1,Zhang Shuang1,
Shao HongZe2,Wang Kai1,Zhao YanLi1

(1.College of Animal Science and Technology of Jilin Agricultural University,JilinChangchun130118; 2.Academy of Animal Science and Veterinary Medicine of Jilin Province,JilinChangchun130062)

This experiment adopted the method of octanoic acid extraction,saturated ammonium sulfate solution to salting out and purify goose egg yolk antibody IgY and analyzed its purity by sodium sulphate polyacrylamide gel electrophoresis.Rabbits were inoculated with the purified IgY and seria were collected,the serum antibody titer was measured.The caprylic acid-ammonium combined with Protein G resin affinity chromatography were used to purify IgG.The purified IgG was labeled with HRP and the titer of labeled antibody was measured by direct ELISA method.The results showed that the purified goose egg yolk IgY reached the concentration of 11.5 mg/mL and purity about 92%.The titer of the antiserum was 1∶32 by agar gel immunodiffusion test.Western blotting test indicated that the rabbit serum contained anti-goose egg yolk IgY with heavy chain and light chain of specific antibody.The purified IgG was labeled with HRP and the titer of the antibody measured by direct ELISA method was 1∶1 100.

Goose;Egg yolk IgY;Purification;HRP-Antibody

S852.4

B

1672-9692(2015)03-0001-05

2015-01-27

趙?。?989-），男，碩士研究生，主要從事動(dòng)物病毒學(xué)研究。

胡桂學(xué)（1963-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物病毒學(xué)。

吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：201231）