余海洋++張宇++王萌

摘 要 為了探明水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的衰老機(jī)制，鑒定了一個(gè)在抽穗期前多數(shù)葉片逐漸死亡的黃色水稻突變體。黃色衰老突變體表型特征為在分蘗期后，其綠色葉片基部隨機(jī)出現(xiàn)斑點(diǎn)，并逐漸擴(kuò)散至整個(gè)葉片。與之相反，野生型葉片在整個(gè)分蘗期均保持綠色。超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，水稻突變體葉片葉綠體類囊體膜和其他細(xì)胞器結(jié)構(gòu)在不同衰老時(shí)期破裂，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)皺縮。在葉片衰老過(guò)程中，突變體葉片光合活性、葉綠素含量和抗氧化酶活性發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的下降。

關(guān)鍵詞 水稻 ；衰老 ；生理特性 ；超微結(jié)構(gòu) ；抗氧化酶

分類號(hào) Q945.45

Physiological Characterizations of a Yellow Mutant

of Rice Oryza sativa L.

YU Haiyang ZHANG Yu WANG Meng

（Environment and Plant Protection College，Hainan University， Haikou， Hainan 570228，China）

Abstract In order to senescent mechanisms in vegetative stages of rice， a yellow senescent mutant of rice （Oryza sativa L.） with progressing death in most of leaves before heading stage was characterized. Its characterization were： at tillering stage， the spots were originally scattered randomly at the base of green leaves in the mutant. Then， the spots expanded to whole leaves which resulted in senescent phenotype with yellow colour. On the contrary， the leaves of wild type remained green at whole tillering stage. Ultrastructure observation in mutant leaves showed breakdown of chloroplast thylakoid membrane structures and other organelles， as well as condensation of the cytoplasm at severe senescent stage. The photosynthetic activities， chlorophyll （Chl） contents and antioxidative enzymes activities decreased irreversibly along with leaf senescent process.

Keywords rice ； senescence ； physiology ； ultrastructure ； antioxidative enzyme

正常的葉片衰老是由于植物組織和器官中營(yíng)養(yǎng)分配引起的[1]。在葉片衰老過(guò)程中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理代謝、基因表達(dá)和生理參數(shù)均發(fā)生顯著變化。葉片衰老阻礙了碳同化作用，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)遲緩并降低產(chǎn)量[2]。在細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面，細(xì)胞膜蛋白和膜系統(tǒng)的降解會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)濃縮，呈現(xiàn)皺縮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。已經(jīng)證明，葉片衰老過(guò)程與一系列生化過(guò)程相關(guān)，其中多數(shù)與光合作用器官的分解有關(guān)[3]。其中，葉綠體類囊體膜降解后，由于吸收的光能不能通過(guò)光合電子傳遞鏈轉(zhuǎn)變成化學(xué)能，會(huì)導(dǎo)致活性氧的上升[4]。采用H2O2誘導(dǎo)植物衰老的實(shí)驗(yàn)證明了衰老與活性粒子之間的關(guān)系[5]。衰老是由于正常生理活性中產(chǎn)生的活性粒子不斷累積所引起的。也有人認(rèn)為，衰老是一個(gè)由病原菌、年齡、激素和編程的基因表達(dá)等多種因素導(dǎo)致的過(guò)程[6-8]。

在水稻生產(chǎn)過(guò)程中，用硅、水楊酸和抗壞血酸預(yù)處理會(huì)提高其生理活性并延緩衰老[9]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻點(diǎn)狀葉片和早衰癥狀是由內(nèi)涵素相關(guān)接頭蛋白復(fù)合體I基因SPL28引起的[10]。牽?；ɑㄋダ吓cERF轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)[11]。此外，分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展又發(fā)現(xiàn)了許多衰老突變體，為研究葉片衰老發(fā)生和防御機(jī)制打下了基礎(chǔ)[12-13]。水稻的生長(zhǎng)可分為3個(gè)時(shí)期，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)（從萌發(fā)到穗分化）、生殖生長(zhǎng)（穗分化到開(kāi)花）和成熟期（開(kāi)花到結(jié)實(shí)）。穗分化后期的衰老研究很多[14]。然而，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期水稻衰老機(jī)制研究很少。本研究在海南省儋州市海南大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)一個(gè)水稻早衰突變體，系統(tǒng)研究其生理變化規(guī)律，為研究水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期衰老機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

水稻品種日本晴（WT）和衰老突變體（ysm）種植在海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院儋州試驗(yàn)基地（19°51′51N；109°55′63E）。磚紅壤，生長(zhǎng)期4～6月的月平均溫度是30℃，平均降水量180 mm，平均濕度97.5%。水稻葉片分蘗后，選取10、20、30 d對(duì)照和突變體基部葉片中間段進(jìn)行分析測(cè)定，取樣時(shí)間為早上8點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 電鏡觀察

采用透射電鏡JEM1230（JOEL，Tokyo，Japan）對(duì)水稻葉片進(jìn)行觀測(cè)。將剪下來(lái)的基部葉片 材料剪碎后固定于3%戊二醛和0.1 mol/L（pH 7.2）磷酸緩沖液中4 h；沖洗后再固定于1%鋨酸（pH 7.2）中4 h，用30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮系列脫水后用環(huán)氧樹(shù)脂SPURR包埋-聚合。在LKB-V型切片機(jī)超薄切片后染色，最后在透射電子顯微鏡下觀察、照相[15]。

1.2.2 葉片葉綠素和β-胡蘿卜素的測(cè)定

采用80%的丙酮提取單位重量葉片色素，室溫閉光放置48 h，中間要混勻多次。混勻后在5 000×g下離心5 min后，按照文獻(xiàn)[16]中方法測(cè)定。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

水稻葉片的光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定采用PAM-2500便攜式熒光儀（Walz. Effeltrich. Germany）進(jìn)行。

1.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定

脯氨酸、丙二醛等生理指標(biāo)測(cè)定參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)定均為6次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖用Origin 9.0科學(xué)繪圖軟件處理。

2 結(jié)果與分析

黃色早衰突變體表現(xiàn)為隨著植株的生長(zhǎng)，下部葉片先產(chǎn)生褐色斑點(diǎn)，但褐色斑點(diǎn)面積不隨衰老程度增加，卻引起水稻葉子不斷變黃，進(jìn)而枯萎，最終導(dǎo)致下部葉片逐漸死亡。這種死亡是階段性的，總是保證每個(gè)分蘗冠層葉片維持生長(zhǎng)。只有新生葉片長(zhǎng)到一定程度時(shí)，該分蘗下部葉子才死亡。對(duì)黃衰突變體黃色斑點(diǎn)的保濕培養(yǎng)和鏡檢分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何細(xì)菌和真菌的存在，這說(shuō)明黃衰突變體不是由細(xì)菌浸染引起的。在褐色斑點(diǎn)剛出現(xiàn)，即DNA降解剛開(kāi)始的時(shí)候 ，葉肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)首先表現(xiàn)出松散，隨后皺縮，引起細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的分離。葉綠體仍然保持完整，但開(kāi)始腫脹。其內(nèi)部的膜結(jié)構(gòu)例如基質(zhì)片層均已降解。 在葉片死后，衰老細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)完全降解之后，但死亡細(xì)胞壁仍然保持完整（圖1）。

從圖2可以看出，水稻突變體分蘗后20和30 d 葉片單位鮮重的色素含量要顯著低于綠葉。綠葉的Chl a、Chl b和β-Car的含量分別為1.55、0.53和0.37 mg/g葉片鮮重。與對(duì)照相比，突變體20 d和30 d水稻葉片的Chl a和Chl b分別下降了76.8%、92.3%和71.7%、83.1%。突變體20和30 d水稻葉片的β-car分別下降了64.9%和54.1%。色素分析表明，20和30 d葉片的Chl a、Chl b和總Chl含量均隨著死亡的加劇呈現(xiàn)極顯著的下降趨勢(shì)，但由于Chl a降解比Chl b快，導(dǎo)致Chl a/b下降。這是植物死亡時(shí)的典型反應(yīng)，即葉綠素酶活性增加，導(dǎo)致葉綠素降解。而β-car則是持續(xù)下降，說(shuō)明衰老開(kāi)始后，由于葉綠素含量的降低，不能有效地淬滅光能，但也無(wú)法采用β-car進(jìn)行過(guò)剩激發(fā)能的淬滅。說(shuō)明伴隨著程序性死亡的加劇，突變體20和30 d水稻葉片的質(zhì)膜葉綠體的膜脂結(jié)構(gòu)均遭到破壞。

從圖3可以看出，隨著衰老程度的不斷加劇，突變體20和30 d水稻葉片原初光化學(xué)效率（Fv/Fm）與對(duì)照相比分別下降了2.9%和15.9%，突變體20 d水稻葉片的電子傳遞速率（ETR），光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和事實(shí)光化學(xué)效率（ΦPSII）與綠葉相比均有所提高，這與黃葉突變體的結(jié)果類似。30 d的電子傳遞速率（ETR），光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）和事實(shí)光化學(xué)效率（ΦPSII）與綠葉相比分別下降了36.6%、15.0%和36.4%，非光化學(xué)淬滅高于綠葉55.6%。

單位重量突變體20 d水稻葉片的SOD活性為綠葉的78.7%，脯氨酸含量為101.1%，MDA含量為103.0%，POD活性為142.5%，ABA含量584.2%。與氧化脅迫緊密相關(guān)的SOD活性下降21.3%，POD活性上升了42.5%，ABA則是顯著提高（圖4）。MDA是反映膜脂過(guò)氧化程度的指標(biāo)，它和脯氨酸不變表明黃葉的膜脂系統(tǒng)在初期沒(méi)有遭到破壞。黃衰突變體的SOD含量顯著下降，說(shuō)明其抗光氧化能力下降。ABA含量顯著上升說(shuō)明其通過(guò)啟動(dòng)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)到途徑導(dǎo)致進(jìn)一步衰老和死亡。

3 討論

衰老可以在植物發(fā)育的時(shí)期自發(fā)發(fā)生，也可以非生物脅迫如缺氧誘導(dǎo)，或是植物與病原菌侵染誘導(dǎo)產(chǎn)生[2，18-19]。前人研究表明，水稻葉片從完全展開(kāi)到衰老過(guò)程其葉綠素含量和光合活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[20]。水稻旗葉衰老過(guò)程中葉綠素含量，葉黃素和熒光發(fā)射強(qiáng)度均呈下降趨勢(shì)，PSI蛋白和PSII蛋白的降解模式略有不同，主要是反應(yīng)中心蛋白復(fù)合體的降解[21-22]。葉綠素a和葉綠素b含量的大量減少是不可逆的死亡標(biāo)志。有人認(rèn)為，功能葉綠體在防止植物細(xì)胞死亡過(guò)程中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃色水稻突變體不同時(shí)期葉片的最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的直線下降表明光能對(duì)其光系統(tǒng)的傷害有增加的趨勢(shì)，這與葉綠體降解的結(jié)果一致。此外，不同衰老程度的葉片非光化學(xué)淬滅（NPQ）具有增加的趨勢(shì)。黃色水稻突變體中qN增加表明低的ΦPSII值是由于對(duì)水解產(chǎn)生電子利用率降低，以及將更多的光能分配給非光化學(xué)淬滅路徑。光化學(xué)淬滅表明了PSII受體側(cè)的氧化還原狀態(tài)，它是由PSII受體光還原速率和其與通過(guò)PSI相耦聯(lián)的CO2再氧化速率相關(guān)。光化學(xué)淬滅也用來(lái)估計(jì)還原態(tài)QA的比例，這反映了對(duì)PSII激發(fā)能的壓力。黃色水稻突變體早期黃色葉片qP的增加是一種對(duì)葉綠素減少的補(bǔ)償效應(yīng)。PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm），又稱為原初光化學(xué)最大效率或PSII光化學(xué)反應(yīng)的潛在效率，通常它反映了完整植物葉片光合器官的生理狀態(tài)。黃葉和枯葉原初光化學(xué)最大效率的下降說(shuō)明了隨著衰老的加劇，光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)不斷遭到破壞。qP是反映PSII激發(fā)能和電子傳遞之間平衡的參數(shù)，NPQ是反映與光化學(xué)相競(jìng)爭(zhēng)的包括熱耗散等能量淬滅的總稱。以上結(jié)果說(shuō)明黃色水稻突變體的黃葉和枯葉分配給PSII，用于光化學(xué)反應(yīng)的激發(fā)能要顯著低于綠色葉片分配光化學(xué)反應(yīng)的光能，并造成非光化學(xué)淬滅的顯著增加。

衰老是指植物營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)的最后階段，發(fā)生在細(xì)胞和器官的大量死亡之前。衰老已經(jīng)被證明是可以由乙烯誘導(dǎo)的，需要核基因的參與，并與O2-和H2O2產(chǎn)量的增加有關(guān)[23-24]。最近發(fā)現(xiàn)H2O2和激素ABA在衰老中具有很大的作用?；钚匝跷镔|(zhì)的產(chǎn)生激發(fā)了信號(hào)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生，引起包括脅迫耐受性，積累和細(xì)胞死亡等幾個(gè)結(jié)果。過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）最先響應(yīng)活性氧分子[25-28]，它們的活性和數(shù)量的變化被認(rèn)為是植物受到脅迫后氧化還原狀態(tài)的指標(biāo)。丙二醛是脂類過(guò)氧化的產(chǎn)物，反映了脂過(guò)氧化的程度，是一個(gè)脂類過(guò)氧化指標(biāo)?；钚匝跷镔|(zhì)和ABA含量被證明在脅迫反應(yīng)中呈正相關(guān)趨勢(shì)[29-30]。本研究結(jié)果表明，丙二醛含量、POD酶活性和ABA含量在黃色水稻葉片中大量增加。因此，推測(cè)黃色衰老突變體是由于光氧化過(guò)程的降解引起的，與活性氧代謝相關(guān)。 但其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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