胡榮鎖++周晶++董文江+趙建平++陸敏泉++宗迎

摘 要 研究旨在應用酶法提取咖啡果皮中膳食纖維，為高品質膳食纖維提取及產業(yè)化開發(fā)應用提供參考。單因素及響應面優(yōu)化纖維素酶法提取咖啡果皮中可溶性膳食纖維的工藝條件，并對其功能特性進行分析。結果表明：纖維素酶法提取的最優(yōu)提取工藝為：超純水（V）∶咖啡果皮粉（m）=100 mL∶6 g，纖維素酶活添加量為22 FPU/mL，酶解溫度40℃，酶解時間2 h，在此工藝條件制備可溶性膳食纖維得率為9.72%；其持水力為（35.72±0.33）g/g，溶脹力為（94.85±0.23）mL/g，結合水力為（26.97±0.54）g/g。

關鍵詞 咖啡 ；果皮 ；可溶性膳食纖維 ；酶法提取

分類號 TS273

Coffee Peel Soluble Dietary Fiber Extraction Technology

via Response Surface Methodology Optimization

and Functional Characteristics Analysis

HU Rongsuo1，3） ZHOU Jing2） DONG Wenjiang1，3）

ZHAO Jianping1，3） LU Minquan1，3） ZONG Ying1，3）

（1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS， Wanning， Hainan 571533， China；

2 Institute of Tropical Bioseience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；

3 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture， Wanning， Hainan 571533， China）

Abstract The aim of enzymatic method extract coffee peel soluble dietary fiber was to provide reference of high quality dietary fiber industrialization development. Single factor and response surface methodology as an approach to optimize the extraction technology of coffee peel soluble dietary fiber， while their functional characteristics were briefly analyzed. The results showed that： the optimum extraction process of cellulase extraction was as follows： ultrapure water （V）∶coffee peel powder （m） =100 mL∶6 g， cellulose enzyme activity adding amount was 22 FPU/mL， enzyme solution temperature was 40℃， enzyme solution time was 2 h， in this process condition the coffee peel soluble dietary fiber yield was 9.72 %. The functional characteristics was as follows： retention ability yield was （35.72±0.33） g/g， swelling force yield was （94.85±0.23） mL/g， bound moisture force yield was （26.97±0.54） g/g.

Keywords coffee ； peel ； soluble dietary fiber ； enzymatic method

膳食纖維（dietary fiber，DF）是一類不為人體消化利用的非淀粉多糖，包括可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）兩大類[1]。SDF具有比IDF更強的生理功能，如降血脂[2]、調節(jié)血糖[3]、預防結腸癌[4-5]、預防便秘、糖尿病[6]、調節(jié)機體免疫[7]和減肥[8]等，因此稱之為人體必需的“第七營養(yǎng)素”。然而許多天然膳食纖維中SDF含量較低，無法達到高品質膳食纖維（SDF≥10%）的要求[9]。

云南省咖啡種植面積已突破12萬hm2，年產副產物40萬t以上，除少量作為肥料還田外，大量堆積廢棄。既是資源的浪費，又會造成環(huán)境污染。對咖啡副產物綜合利用研究，目前國內只見綜述性論文發(fā)表[10]，而國外對咖啡副產物研究較為系統(tǒng)深入，咖啡果皮、咖啡渣、咖啡銀皮、咖啡殼等均有涉獵。在膳食纖維方面僅有咖啡銀皮研究，其水溶性膳食纖維含量達到總膳食纖維的86%，并將其應用到焙烤食品中[11]。

本研究利用響應面酶法提取咖啡果皮中的膳食纖維，酶法提取具有操作簡單、條件溫和、對環(huán)境破壞小、產品品質高的特點，是提取咖啡果皮膳食纖維最佳方式之一。并利用響應面法優(yōu)化，以獲得利用商用酶提取膳食纖維提取的最佳工藝條件，旨在為咖啡果皮高品質水溶性膳食纖維的產業(yè)化開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

云南小粒種咖啡果皮由云南農業(yè)大學熱帶作物學院協助收集。纖維素酶為Celluclast 1.5 L，自黑曲霉（Aspergillus niger）中提取，購自諾維信公司（Novozymes）公司，無水乙醇、鹽酸、丙酮等均為分析純，配制用水為超純水。

1.1.2 主要儀器與設備

Master-s-plus UVF超純水系統(tǒng)，上海和泰有限公司；XMTD-8222型水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；AL 104型電子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HB 10 digital型旋轉蒸發(fā)儀，德國iKA公司；Z36HK型離心機，德國Hermle公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預處理

收集采用濕法加工的咖啡果皮，采用日曬法干燥，將咖啡果皮水分降至12%以下，保存?zhèn)溆谩?/p>

提取前將咖啡果皮烘干至水分含量5%左右，粉碎，過20目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 纖維素酶酶活測定

酶活測定采用濾紙酶活法檢測纖維素酶總酶活，測定方法采用杜敏的方法[12]。

1.2.3 纖維素酶法提取可溶性膳食纖維

準確稱取咖啡果皮粉，按一定料液比加入超純水，加入一定量的纖維素酶后水浴提取，過濾，濾液真空濃縮至5～10 mL倒出，加水沖洗濃縮瓶，收集濃縮液和沖洗液，定容至10 mL，加入40 mL無水乙醇，靜置沉淀1 h，抽濾，于80 ℃烘干濾渣，稱重，計算得率[13]。

1.2.4 SDF得率計算

SDF得率（%）=[SDF質量（g）/咖啡果皮質量（g）]×100%

1.2.5 實驗設計

單因素實驗：固定其他條件，分別探討料液比、酶用量、酶解溫度和酶解時間對SDF提取得率的影響。各因素實驗重復3次，取平均值。

結合單因素實驗結果，根據BoX-Behnken實驗設計原則，應用響應面法優(yōu)化SDF提取條件。

1.2.6 膳食纖維的化學特性測定

1.2.6.1 持水力[14-15]

稱取一定量SDF放入燒杯中，按1∶20 （質量體積比）比例加入去離子水，充分混勻，室溫下靜置24 h，在定量濾紙上瀝干樣品水分，并將其迅速轉入表面皿中稱重。按下式計算持水力：

持水力=[樣品濕重（g）-樣品干重（g）]/樣品干重（g）

1.2.6.2 膨脹力[14-15]

稱取一定量樣品，按l∶20（質量體積比）比例加入去離子水，充分混勻，室溫下放置24 h，讀取量筒中液體樣品的體積。按下式計算膨脹力：

膨脹力=[溶脹后纖維體積（mL）-干品體積（mL）]/樣品干重（g）

1.2.6.3 結合水力[14，16]

稱取一定量SDF放入燒杯中，按1∶20（質量體積比）比例加入去離子水，充分混勻，室溫下靜置24 h，在定量濾紙上瀝干樣品水分，將濕樣移入離心管中，在6 000 r/min 條件下離心5 min 后棄去水分，所獲得濕樣所含水分即為結合水，其與干樣的重量之比即為結合水力。按下式計算結合水力：

結合水力=[離心后樣品濕重（g）-樣品干重（g）]/樣品干重（g）

1.2.7 數據統(tǒng)計分析

采用DPS軟件對單因素實驗結果進行顯著性分析。應用Design Expert 8.0.5軟件的BoX-Behnken實驗設計建立數學模型，并進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶總酶活測定

葡萄糖溶液標準曲線見圖1。

Celluclast 1.5 L為商用復合纖維素酶，含有內切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和纖維素二糖酶（BG）等多種成分，其酶活未知，因此測定其總酶活，即濾紙酶活（Filter paper activity，簡稱FPA）。采用Ghose方法[17-19]，進行酶活檢測。

葡萄糖標準曲線見圖1，其線性回歸方程y=0.217 8X-0.017 5，R2=0.997 0，由此可知葡萄糖質量為2.0 mg時的吸光度值為0.418 4。

使用紙條纖維酶法檢測，濾紙酶活檢測曲線見圖2，其線性回歸方程y=0.863 5X+0.252 9，葡萄糖生成2.0 mg時，酶濃度為1.980 mL/L。帶入公式（FPA=0.185/生產2 mg葡萄糖時酶濃度）[20]，得出纖維素酶Celluclast 1.5 L在自然pH值，50℃下的濾紙酶活為93.4 FPU/mL。

2.2 SDF提取單因素實驗

為了提高響應面實驗準確性，按實驗方法中所述進行單因素實驗，結果見表1。

由表1可知，料液比在0.5（即1∶20）、酶解溫度50℃和酶解時間3 h時SDF得率有最大值，雖然隨著酶活添加量的增加SDF增加，但在30 FPU/mL之后增加幅度小，因此酶活添加量選擇30 FPU/mL和其它3個最大值作為響應面分析零點，進行下一步分析。

2.3 SDF提取的響應面優(yōu)化

2.3.1 響應面實驗因素水平的選取及結果

結合單因素實驗結果，以料液比（A）、纖維素酶活添加量（B）、酶解溫度（C）、酶解時間（D）為自變量，SDF提取率（Y）為響應值，設計四因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和SDF得率之間的函數關系。各實驗因素與水平見表2，響應面實驗設計及結果見表3。

2.3.2 模型的建立和顯著性檢驗

利用Design Expert軟件對表2中的結果進行多元回歸擬合，得到SDF得率對纖維素酶活添加量、pH值、超聲溫度、超聲時間的回歸模型：

Y=9.37+0.13A-0.19B-0.084C+0.092D-0.34AB-0.52AC-0.16AD+0.035BC+0.21BD+0.49CD-0.85A2-0.49B2-0.26C2-0.13D2

響應面實驗結果方差分析見表4。

模型的方差分析（表3）表明，失擬項不顯著（p=0.208 8>0.05），而模型p<0.01，模型差異高度顯著，模型確定系數R2=0.847 5，調整確定系數Adj R2=0.695 0，表明模型能較好地反映各因素與響應值的變化關系，可用于預測實際SDF的提取率。在α=0.05顯著水平上剔除不顯著項，得到簡化方程：

Y=9.37-0.52 AC+0.49 CD-0.85 A2-0.49 B2

2.4 主效應分析

各因素的P值可以反映出各因素對實驗指標的重要性，P值越小，表明該因素對實驗結果影響越大[20]。由表3可知，4個實驗因素對SDF提取率影響大小依次為酶活添加量>料液比>酶解時間>酶解溫度。

2.4.1 單因素效應分析

回歸方程中的4個因素任意3個固定在零水平，將實驗因素分別固定在-1、-0.5、0、0.5、1五個水平，各因素不同水平的SDF提取率，并以此作圖，結果見圖3。

由圖3可知，隨自變量變化，各因素效應呈開口向下的拋物線狀。在中心極值點處，咖啡果皮SDF提取率最高，偏離極值點SDF提取率下降，但下降幅度各異，其中A（料液比）下降最大，其次為B（酶活添加量），而D（酶解時間）下降最小。

2.4.2 兩因素間交互效應分析

響應面及等高線圖能夠直觀地反映出各個因素及其交互作用，利用Design Expert軟件即可以作出兩因素交互作用的響應面圖及其等高線圖，結果見圖4。通過主效應分析可知酶解溫度和酶解時間對SDF得率的影響較小，同時通過單因素效應分析可知兩者對得率的影響小，且較為接近，因此兩因素間交互效應分析不再進行酶解溫度和酶解時間比較。

2.5 最優(yōu)組合的確定及驗證

利用Design Expert軟件對模型求解，得到咖啡果皮中SDF最優(yōu)提取條件：酶活添加量22.00 U/mL、料液比0.06、酶解時間2.00 h、酶解溫度40.00℃，模型預測值為9.72%。為驗證模型的適用性與可靠性，結合實際可操作性，在加酶量22.00 U/mL、料液比0.06、酶解時間2.00 h、酶解溫度40.0℃進行驗證性實驗，所得SDF平均提取率為9.78%，與預測值基本相符。

2.6 膳食纖維功能特性研究

對咖啡果皮SDF持水力、膨脹力、結合水力能力進行功能檢驗，結果見表5。

由表5 可知，SDF 的持水力、膨脹力、結合水力能力都較好。說明SDF對于預防便秘和結腸癌的發(fā)生具有積極的作用。

3 討論與結論

SDF提取方法較多，如物理法、化學法、酶法、化學酶法、物理酶法等，各方法均有優(yōu)缺點。酶法反應條件溫和，速度快，專一性強，所得SDF純度高、無異味，因此酶法是工業(yè)化生產高品質SDF最佳提取方法之一。本實驗所使用的為商用復合纖維素酶，該酶獲得較易，價格便宜，操作性強，本實驗所得的結論可為SDF工業(yè)化提取提供參考。

咖啡果皮SDF最佳得率達到9.72%，接近高品質SDF（≥10%）的要求。本實驗僅對纖維素酶參數進行了驗證，劉銘等[21]發(fā)現醇沉也會對SDF提取造成影響，小于6 h時SDF得率呈上升趨勢；Zhang Juan[22]等用6種方法提取SDF，發(fā)現酶法提取得率（6.34%）相對于物理酶法（68.71%）等幾種方法提取率低，因此本實驗檢測咖啡果皮SDF得率也并非最高得率。

對咖啡果皮SDF持水力、膨脹力、結合水力進行了初步研究，效果良好，說明該SDF具有良好的應用前景，但其最佳提取方法、組成和功能特性尚需進一步研究。

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