莊玉粉++郭秀麗++劉進(jìn)平

摘 要 對(duì)天然橡膠生物合成途徑進(jìn)行綜述，并根據(jù)橡膠草和巴西橡膠樹(shù)的生物學(xué)特點(diǎn)，提出將橡膠草作為研究橡膠生物合成的模式植物。橡膠草作為產(chǎn)膠模式植物，將會(huì)極大地推動(dòng)天然橡膠生物合成與調(diào)控機(jī)理的研究，提高目前的科研產(chǎn)出。

關(guān)鍵詞 天然橡膠 ；生物合成 ；橡膠草 ；巴西橡膠樹(shù) ；模式植物

分類(lèi)號(hào) S7 ；Q945.11

Russian Dandelion： An Excellent Model Plant

for the Study of Rubber Production

ZHUANG Yufen GUO Xiuli LIU Jinpin

（Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources /

College of Agronomy， Hainan University， Haikou，Hainan 570228）

Abstract The biosynthesis pathway of natural rubber was reviewed， and Russian dandelion （Taraxacum koksaghyz） was proposed as a model plant for studies of rubber biosynthesis based on the comparison of the biological characteristics of Russian dandelion and rubber tree （Hevea brasiliensis）. We believe that it will greatly promote the research in the natural rubber biosynthesis and its regulation mechanism， and increase the research output for this area regarding Russian dandelion as a mode plant for the study of rubber production.

Keywords natural rubber ； rubber biosynthesis ； Russian dandelion ； rubber tree ； model plant

天然橡膠是世界上的四大工業(yè)原料之一，被廣泛運(yùn)用在國(guó)防、交通運(yùn)輸、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、機(jī)械制造、醫(yī)藥衛(wèi)生和日常生活等多個(gè)方面，是國(guó)防和工業(yè)制造中不可或缺的原料。天然橡膠目前主要是從橡膠樹(shù)上收獲而得的，它的主要成分為聚異戊二烯（cis-1，4，-polyisoprene），是利用光合作用制造的同化物，經(jīng)次生代謝途徑而生物合成。雖然天然橡膠的合成研究已取得了不少進(jìn)展，但由于巴西橡膠樹(shù)自身的生物學(xué)特點(diǎn)，存在對(duì)天然橡膠生物合成研究的瓶頸，為了推動(dòng)天然橡膠生物合成與調(diào)控機(jī)理的研究，提高目前的科研產(chǎn)出，探討以巴西橡膠樹(shù)替代作物橡膠草作為模式生物研究橡膠生物合成的可能性。

1 天然橡膠的生物合成

天然橡膠生物合成大體可分為兩步：第一步是前體物合成；第二步是橡膠鏈的合成。

1.1 前體物合成

橡膠生物合成所需要的單體模塊為異戊二烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate， IPP或IDP），起始分子包括3，3-二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate， DMAPP或DMADP）、牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate， GPP或GDP）、法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate， FPP或FDP）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate， GGPP或GGDP）[1]。

橡膠前體物被認(rèn)為是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA）途徑合成的[1]。Sando等[2]曾利用位素示蹤表明橡膠生物合成是通過(guò)MVA途徑，而不是通過(guò)質(zhì)體中的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate， MEP）途徑。但他們是利用橡膠35 d的實(shí)生苗進(jìn)行示蹤實(shí)驗(yàn)的，成熟的橡膠樹(shù)膠乳合成是否也如此不得而知。鑒于越來(lái)越多的證據(jù)表明，這兩條途徑存在串?dāng)_（crosstalk）和共同的類(lèi)異戊二烯前體物相互交換[3-4]，因此也不能排除在橡膠合成過(guò)程中這兩條途徑存在互相作用和產(chǎn)物互換（圖1）。在橡膠膠乳和葉片中發(fā)現(xiàn)5-磷酸脫氧木酮糖合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase， DXS）表達(dá)說(shuō)明，可能在乳管中存在MEP途徑[5]。最近對(duì)橡膠樹(shù)死皮樹(shù)錄組分析表明，合成IPP的這兩條途徑的關(guān)鍵酶基因都明顯下調(diào)[6]，顯示天然橡膠合成中MVA和MEP途徑可能存在某種方式的互作。

MEP途徑主MVA途徑和前體物都是來(lái)源于光合作用的產(chǎn)物——蔗糖。MEP途徑的前體物3-磷酸甘油醛（glyceraldehyde phosphate，GAP）和丙酮酸為糖酵解產(chǎn)物，而MVA途徑的前體物乙酰-CoA是經(jīng)糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑生成的。

MEP途徑中，DXS催化GAP和丙酮酸的酮醇偶聯(lián)縮合生成5-磷酸脫氧木酮糖（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate，DXP）。DXP由5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（DXP reducto-isomerase，DXR或IspC）催化形成MEP。MEP向二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖[4-（cytidine-5′-diphospho）-2-C-methyl-D-erythritol或4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol，CDP-ME]轉(zhuǎn)變則由4-磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖合成酶（CDP-ME synthase，MCT、CMS或IspD）催化。之后CDP-ME激酶（CDP-ME kinase，CMK或IspE）使CDP-ME磷酸化形成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸（4-diphosphocytidyl-2-Cmethyl-D-erythritol-2-phosphate，CDP-MEP）。CDP-MEP環(huán)化形成2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2，4-環(huán)二磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphate，MEP-cPP）則由MEP-cPP合成酶（MEP-cPP synthase，MDS或IspF）催化。MEP-cPP形成（E）-4-羥基-3-甲丁-2-烯基二磷酸（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate，HMBPP）由HMBPP合成酶或1-羥基-2-甲基-2-（E）-丁烯-4-二磷酸合成酶（HMBPP synthase，HDS或IspG）催化。然后HMBPP還原酶（HMBPP reductase，HDR或IspH）催化HMBPP形成IPP和DMAPP。IPP異構(gòu)酶（IPP isomerase， IDI或IPI）可催化IPP和DMAPP相互轉(zhuǎn)化。

MVA途徑的第一步反應(yīng)是乙酰-CoA在乙?；D(zhuǎn)移酶（acetyl-CoA acetyltransferase， AACT）催化下，2分子乙酰-CoA縮合成乙酰乙酰-CoA（acetoacetyl coenzyme A）。乙酰乙酰-CoA經(jīng)3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase， HMGS）催化合成3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A， HMG-CoA）。之后經(jīng)HMG-CoA 還原酶（HMG-CoA reductase， HMGR）催化還原成MVA。MVA經(jīng)兩步磷酸化過(guò)程，經(jīng)甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase， MVK）催化形成甲羥戊酸-5-磷酸（5-phosphomevalonate， MVP或MVAP），經(jīng)甲羥戊酸-5-磷酸激酶（phosphomevalonate kinase， PMK或 PMVK）形成甲羥戊酸-5-焦磷酸（5-diphosphomevalonate， MVPP或MVAPP）。MVPP經(jīng)甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶（mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase， PMD或MVD）脫羧形成IPP。IPP和DMAPP可經(jīng)IDI相互轉(zhuǎn)化。IPP在法尼基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase， FPS）的作用下與DMAPP合成FPP。

需要說(shuō)明的是，除形成橡膠外，IPP、DMAPP、GPP、FPP和GGPP等可進(jìn)一步形成異戊二烯單元組成的其他化合物及其衍生物，包括單萜類(lèi)（如薄荷醇）、雙萜類(lèi)（如赤霉素、脫落酸、蓖麻烯）、倍半萜類(lèi)（如衣殼醇）、異戊二烯基類(lèi)（如細(xì)胞分裂素）、多聚異戊二烯醇（如多萜醇、酶Q、質(zhì)體醌、類(lèi)胡蘿卜素、葉綠素）、固醇類(lèi)（如菜油甾醇）等次生代謝產(chǎn)物[7]。

1.2 橡膠鏈的合成

天然橡膠主要成份為聚異戊二烯（cis-1，4-polyisoprene），聚異戊二烯鏈在橡膠粒子表面合成。橡膠粒子存在于巴西橡膠樹(shù)[Hevea brasiliensis （Willd. ex. A.Juss.） Muell. Arg]的膠乳細(xì)胞中。

橡膠鏈的合成中，起始過(guò)程需要1 分子反式構(gòu)型的烯丙基焦磷酸（如DMAPP、GPP、FPP 或GGPP）作為起始分子或引物。反式-異戊烯轉(zhuǎn)移酶（transprenyltransferase， TPT）催化IPP單體以反式構(gòu)型頭尾相接地?fù)饺隓MAPP，產(chǎn)生GPP、FPP和GGPP（圖2）。DMAPP、GPP、FPP和GGPP等雖然都可以作起始分子，但以橡膠樹(shù)等物種的體外橡膠生物合成中，F(xiàn)PP起始的橡膠合成最有效率。加上FPP是在細(xì)胞質(zhì)中合成，因此在橡膠樹(shù)中FPP是最有可能的起始分子[1，8-9]。

順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase， CPT）催化IPP單體以順式構(gòu)型頭尾相接地添加到結(jié)合于起始分子上，形成長(zhǎng)短不等的橡膠分子。橡膠鏈延伸過(guò)程需要二價(jià)金屬陽(yáng)離子Mg2+或Mn2+參與[8-9]。

由于橡膠粒子與天然橡膠合成緊密聯(lián)系，分離到的橡膠粒子可以產(chǎn)生橡膠，同時(shí)破壞橡膠粒子則會(huì)破壞橡膠生物合成，因此表明橡膠粒子是橡膠轉(zhuǎn)移酶活性必不可少的組分。橡膠粒子上的蛋白質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量隨不同物種而異。目前較為清楚橡膠樹(shù)的橡膠粒子具有數(shù)量較多的蛋白。其中比重最大的是14-ku的橡膠延長(zhǎng)因子（rubber elongation factor， REF）和22-ku的橡膠小粒子蛋白（small rubber particle protein， SRPP）[1]。

2 天然橡膠生物合成研究瓶頸

目前巴西橡膠樹(shù)研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但存在較大的瓶頸，限制了對(duì)巴西橡膠樹(shù)的深入研究。以橡膠樹(shù)的橡膠生物合成為例，雖然大體的合成途徑已經(jīng)清楚，前述IPP生物合成的MEP途徑、MVA途徑及后繼的橡膠鏈合成途徑中的重要基因已經(jīng)克隆[10]，但MEP途徑是否參與橡膠合成，IPP合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)ο鹉z合成的數(shù)量（橡膠產(chǎn)量）和質(zhì)量（如橡膠鏈的長(zhǎng)短）的影響和貢獻(xiàn)并不清楚，對(duì)其分子調(diào)控機(jī)理也了解不多。對(duì)這些方面的任何進(jìn)展都需要對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行克隆和遺傳轉(zhuǎn)化，通過(guò)對(duì)這些基因的（利用強(qiáng)啟動(dòng)子）過(guò)量表達(dá)和（利用反義基因）沉默表達(dá)來(lái)觀察其對(duì)橡膠合成的影響。然而，橡膠樹(shù)本身組織培養(yǎng)比較困難，遺傳轉(zhuǎn)化成功率極為有限，此外，即便遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株，因?yàn)橄鹉z樹(shù)為多年生木本植物，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，存在幼態(tài)和成熟兩種狀態(tài)，橡膠樹(shù)需要在田間生長(zhǎng)5～7 a才能割膠，等到能收獲膠乳以確定對(duì)性狀的影響也需要在5～7 a之后[11-12]。這些都是目前以巴西橡膠樹(shù)為對(duì)象的天然橡膠生物合成的研究瓶頸。

3 巴西橡膠樹(shù)替代植物研究現(xiàn)狀

已報(bào)道有2 500種以上的植物可以產(chǎn)生橡膠，但絕大多數(shù)為熱帶植物。巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是目前商業(yè)化種植面積最大、產(chǎn)量最多的產(chǎn)膠植物，植膠區(qū)主要分布于亞洲、非洲和南美等熱帶及亞熱帶地區(qū)，其中亞洲橡膠產(chǎn)量占全球93%。由于巴西橡膠樹(shù)主要產(chǎn)于熱帶地區(qū)，且易受南美葉疫病感染，而絕大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家依賴(lài)進(jìn)口，所以歐盟、美國(guó)、澳大利亞等國(guó)相繼開(kāi)展了巴西橡膠樹(shù)替代產(chǎn)膠植物研究。目前研究最多的2種替代產(chǎn)膠植物為銀膠菊（英文名：Guayule，拉丁學(xué)名：Parthenium argentatum Gray）和橡膠草（又名俄羅斯蒲公英，英文名：Russian dandelion，拉丁學(xué)名：Taraxacum koksaghyz Rodin）。

國(guó)內(nèi)已有作者對(duì)橡膠草的研究進(jìn)展及作為巴西橡膠樹(shù)替代作物研發(fā)進(jìn)行了詳盡的綜述[13-16]，這里主要就橡膠草作為模式生物研究橡膠生物合成意義和可能性進(jìn)行論述，希望引起國(guó)內(nèi)研究者的注意。

4 橡膠草作為模式生物研究橡膠生物合成的可能性

與多年生的木本植物巴西橡膠樹(shù)相比，橡膠草有很多優(yōu)勢(shì)。首先，它為菊科菊苣族蒲公英屬的多年生草本植物，在溫帶可以如菊苣一樣種植，作為一種一年生植物（從播種到收獲需1年）開(kāi)發(fā)[11-12]。這樣就可避免經(jīng)歷橡膠樹(shù)慢長(zhǎng)的幼態(tài)期之后才能對(duì)其膠乳產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)估。

其次，橡膠草組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化都比較容易，獲得的轉(zhuǎn)化苗達(dá)到產(chǎn)膠狀態(tài)所需時(shí)間短。轉(zhuǎn)基因的橡膠草植株4個(gè)月就可以成熟，在移栽到田間的頭兩個(gè)月就能產(chǎn)生可檢測(cè)數(shù)量的橡膠。而另外一種巴西橡膠樹(shù)替代作物銀膠菊雖然也是草本植物，但它需要在田間生長(zhǎng)2年才能進(jìn)行橡膠分析[11-12]。橡膠草遺傳轉(zhuǎn)化的這種便利性非常適合利用過(guò)量表達(dá)和沉默表達(dá)來(lái)研究天然橡膠生物合成途徑中關(guān)鍵基因?qū)ο鹉z合成的影響及其調(diào)控機(jī)制。

第三，橡膠草核型為2n=2x=16，基因組為1 450 Mb[10]；巴西橡膠樹(shù)2n=4x=36，具有雙二倍體特征，其單倍體基因組大小約4×109 bp[17]。橡膠樹(shù)產(chǎn)膠部位為樹(shù)皮，橡膠草產(chǎn)膠部位為根，兩者都有類(lèi)似的乳管系統(tǒng)，但橡膠草不能如橡膠一樣切割收獲，必須將根攪碎后進(jìn)行壓榨或提取橡膠。而銀膠菊則無(wú)乳管或相連的乳管網(wǎng)絡(luò)，收獲膠乳需要研磨植物組織以釋放橡膠粒子[11-12]。對(duì)橡膠草和巴西橡膠樹(shù)進(jìn)行比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)將獲得更多產(chǎn)膠相關(guān)的分子信息。

總之，對(duì)橡膠草的研究，不僅是作為替代產(chǎn)膠植物本身，也將為巴西橡膠樹(shù)乳管發(fā)育、橡膠粒子形成和橡膠合成研究提供重要的參考信息，因此，就象水稻作為單子葉禾本科類(lèi)糧食作物的優(yōu)良模式植物一樣，橡膠草也是一種優(yōu)良的產(chǎn)膠模式植物，預(yù)計(jì)未來(lái)對(duì)其研究產(chǎn)出將會(huì)有較大增長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)

[1] Puskasa J E， Gautriauda E，Deffieuxb A， et al. Natural rubber biosynthesis-A living carbocationic polymerization[J]. Progress in Polymer Science， 2006， 31 （6）： 533-548.

[2] Sando T， Takeno S， Watanabe N， et al. Cloning and characterization of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate （MEP） pathway genes of a natural rubber producing plant， Hevea brasiliensis[J].Biosci Biotechnol Biochem， 2008， 72 （11）： 2 903-2 917.

[3] Rodríguez-Concepción M. Early Steps in Isoprenoid Biosynthesis： Multilevel Regulation of the Supply of Common Precursors in Plant Cells[J]. Phytochemistry Reviews， 2006， 5（1）： 1-15.

[4] Rodríguez-Concepción M， Campos N， Ferrer A，et al. Biosynthesis of isoprenoid precursors in Arabidopsis[M]. In： Bach TJ， Rohmer M （eds.）， Isoprenoid Synthesis in Plants and Microorganisms： New Concepts and Experimental Approaches， Springer Science+Business Media， New York， 2013： 439-456

[5] Ko J H， Chow K S， Han K H. Transcriptome analysis reveals novel features of the molecular events occurring in the laticifers of Hevea brasiliensis （para rubber tree）[J]. Plant Mol Biol， 2003， 53 （4）： 479-492

[6] Liu J P， Xia Z Q， Tian X Y， et al. Transcriptome sequencing and analysis of rubber tree （Hevea brasiliensis Muell.） to discover putative genes associated with tapping panel dryness （TPD） [J]. BMC Genomics， 2015， 16： 398.

[7]李 莉，高凌云，董 越，等. 植物類(lèi)異戊二烯生物合成相關(guān)酶基因研究進(jìn)展[J]. 浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，31（4）：461-466.

[8] 代龍軍，曾日中. 產(chǎn)膠植物橡膠轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（10）：1 000-1 008.

[9] 鄒 智，楊禮富，王真輝，等. 橡膠樹(shù)中橡膠的生物合成與調(diào)控[J]. 植物生理學(xué)通訊，2009，45（12）：1 231-1 238.

[10] Sando T， Takaoka C， Mukai Y， et al. Cloning and characterization of mevalonate pathway genes in natural rubber producing plant， Hevea brasiliensis[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2008， 72 （8）： 2 049-2 060.

[11] Whalen M， McMahan C， Shintani D. Development of crops to produce industrially useful natural rubber[M]. In： Bach TJ， Rohmer M （eds.）， Isoprenoid Synthesis in Plants and Microorganisms： New Concepts and Experimental Approaches， Springer Science+Business Media， New York， 2013： 329-345.

[12] Van Beilen JB， Poirier Y. Establishment of new crops for the production of natural rubber. Trends in Biotechnology[J]. 2007， 25（11）： 522-529.

[13] 仇 鍵，張繼川，羅世巧，等. 橡膠草的研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào)，2015，50（1）：133-141.

[14] 林伯煌，魏小弟. 橡膠草的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（37）：5 950–5 951.

[15] 安 鋒，林位夫，謝貴水，等. 國(guó)內(nèi)外巴西橡膠樹(shù)替代作物及技術(shù)研發(fā)現(xiàn)狀[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2012，33（6）：1 134-1 141.

[16] 趙平娟，安 鋒，林位夫，等. 大力開(kāi)展巴西橡膠樹(shù)替代產(chǎn)膠植物及技術(shù)研發(fā)的建議[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（34）：124-130.

[17] Roy C B， Nazeer M A， Saha T. Identification of simple sequence repeats in rubber （Hevea brasiliensis） [J]. Curr Sci， 2004， 87： 807-811.