馬明侖，陳功義，宋志元，劉三俠，張要齊*

（1.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 新鄉(xiāng)　453003；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院；3.河南惠通天下生物工程有限公司）

益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥工藝的研究

馬明侖1，陳功義2，宋志元3，劉三俠3，張要齊3*

（1.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 新鄉(xiāng)453003；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院；3.河南惠通天下生物工程有限公司）

目前，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)抗生素的濫用現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，其所導(dǎo)致的負(fù)面效應(yīng)也日益顯著。因此，開發(fā)安全、綠色、無毒的新型飼用抗生素替代品，對(duì)我國綠色畜牧業(yè)的發(fā)展意義重大。中草藥飼料添加劑不僅能提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，而且還具有毒副作用小、殘留低、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前研究的熱點(diǎn)。發(fā)酵作為中草藥的一種炮制方法，能提高中草藥藥效，降低毒副作用，同時(shí)產(chǎn)生新的藥效物質(zhì)。該研究選用黃芪、當(dāng)歸等中草藥按比例組成復(fù)方，利用糞腸球菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵，以粗多糖含量和活菌數(shù)為檢測(cè)指標(biāo)，用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定其最佳發(fā)酵工藝，為新型飼用抗生素替代品的研制提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

菌種：糞腸球菌（購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；藥材與試劑：中藥材（購自中藥材市場(chǎng)）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉（購自北京某生物技術(shù)有限公司），糞腸球菌肉湯培養(yǎng)基、糞腸球菌瓊脂（購自青島某生物技術(shù)有限公司），硫酸、乙醇、蒽酮以及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)儀器

中藥粉碎機(jī)；超凈工作臺(tái)；數(shù)控超聲波提取機(jī)；離心機(jī)；紫外分光光度計(jì)；高壓蒸汽滅菌鍋；電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化

挑取兩環(huán)斜面保存的糞腸球菌于活化培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)20～24 h，至對(duì)數(shù)生長期菌液的濃度為0.8 108～1.0 108CFU/mL時(shí)，制備得到一級(jí)種子菌液，用于發(fā)酵中草藥。

1.3.2復(fù)方中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

黃芪和當(dāng)歸粉碎后過80目篩，取復(fù)方中草藥粉末10 g加入三角瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，同時(shí)添加一定比例的葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值為7.0，115℃高壓滅菌15 min，冷卻后備用。

1.3.3復(fù)方中草藥的發(fā)酵

將制備的一級(jí)種子菌液加入復(fù)方中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基中，用封口膜封好，在設(shè)定溫度下培養(yǎng)，以粗多糖含量和活菌數(shù)為檢測(cè)指標(biāo)，篩選最適接菌量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度，再設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。發(fā)酵液中活菌數(shù)的測(cè)定采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.3.4菌液接種量對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

向制備的復(fù)方中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基中接種一級(jí)種子液，菌液接種比例分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.0，37℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數(shù)，確定最佳菌液接種量。試驗(yàn)分為四組，每組3個(gè)重復(fù)，下同。

1.3.5發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

分別用0.5M HCl和0.5M NaOH調(diào)節(jié)復(fù)方中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，高壓滅菌，冷卻后接種一級(jí)種子菌液，接種量由1.3.4節(jié)確定，用封口膜封好，37℃發(fā)酵培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)粗多糖含量及糞腸球菌活菌數(shù)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳初始pH值。

1.3.6發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

接種一級(jí)種子菌液于中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量由1.3.4節(jié)確定，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值由1.3.5節(jié)確定，用封口膜封好，37℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數(shù)，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.7發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

接種一級(jí)種子菌液于復(fù)方中草藥發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量由1.3.4節(jié)確定，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值由1.3.5節(jié)確定，發(fā)酵時(shí)間由1.3.6節(jié)確定，發(fā)酵溫度分別為33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數(shù)，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.3.8正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方中草藥的發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)條件下確定適合復(fù)方中草藥發(fā)酵的菌液接種量、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的最適值。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取菌液接種量（A）、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗多糖含量及糞腸球菌活菌數(shù)，確定最佳發(fā)酵工藝。

1.3.9葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL的0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液置于預(yù)先編號(hào)的10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，然后分別吸取1.0 mL至具塞試管中，置冰水浴中5 min，再迅速加入現(xiàn)配的2%蒽酮-濃硫酸試劑4.0 mL，沸水浴中加熱10 min，迅速置于冰水浴冷卻5 min，室溫靜置5 min，另取蒸餾水1.0 mL，同樣操作作為空白對(duì)照，在620 nm處測(cè)定吸光度值。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y=0.413X-0.015（R2= 0.9999）。

1.3.10粗多糖含量的測(cè)定

粗多糖的提?。褐胁菟幒娓珊螅鬯?，過80目篩，按比例配成12 g放入三角瓶中用玻璃棒攪拌均勻，在超凈工作臺(tái)中紫外照射30 min，然后準(zhǔn)確稱取0.5 g放入250 mL具塞三角瓶中，加入45 mL 80%乙醇靜置浸泡30 min，并超聲破碎30 min，過濾，多次用75%酒精洗滌藥渣，棄去濾液；將濾渣放入烘箱中烘干，加入2%鹽酸45 mL，沸水浴1 h，冷卻后過濾到100 mL容量瓶中，重復(fù)提取1次，合并濾液，用2%鹽酸定容，備用。

粗多糖含量的測(cè)定：采用蒽酮-硫酸法。測(cè)得發(fā)酵前中草藥中粗多糖含量為8.32%。

1.3.11數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1菌液接種量對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

圖1　菌液接種量對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

不同菌液接種量對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響如圖1所示。由圖1可知，菌液接種量為5%時(shí)，粗多糖含量和活菌數(shù)均達(dá)到最高值，隨著接種量的繼續(xù)增大，兩者均有明顯的降低。因此，單因素條件下5%為最佳菌液接種量。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響如圖2所示。當(dāng)初始pH值＜7.0時(shí)，粗多糖含量和活菌數(shù)均隨著pH值的增大而逐漸升高；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，兩者均達(dá)最高。隨著pH值繼續(xù)升高，兩者均逐漸下降。因此，單因素條件下pH值7.0為最佳發(fā)酵初始pH值。

圖2　發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

2.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，粗多糖含量和活菌數(shù)均不斷升高，發(fā)酵72 h時(shí)，兩者均達(dá)最高，繼續(xù)發(fā)酵，活菌數(shù)大幅度下降，粗多糖含量也有明顯下降。因此，單因素條件下72h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.4發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)溫度為37℃時(shí)，粗多糖含量和活菌數(shù)均達(dá)到最高，當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時(shí)，兩者含量降低并逐漸趨于穩(wěn)定。因此，單因素條件下37℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.5正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)方中草藥的發(fā)酵條件

由單因素試驗(yàn)確定正交試驗(yàn)各因素的水平值見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖4　發(fā)酵溫度對(duì)復(fù)方中草藥發(fā)酵的影響

表1　正交試驗(yàn)因素與水平

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

由表2可以看出，影響發(fā)酵后粗多糖含量及活菌數(shù)的三個(gè)因素的主次順序?yàn)椋篊（發(fā)酵時(shí)間）＞A（菌液接種量）＞B（發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值）。最佳發(fā)酵工藝組合為：A2B3C2。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間和菌液接種比例對(duì)發(fā)酵后粗多糖含量影響差異極顯著（P＜0.01），對(duì)活菌數(shù)的影響差異顯著（P＜0.05），而發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對(duì)兩者的影響均不顯著（P＞0.05）。綜上可知，復(fù)方中草藥最佳發(fā)酵工藝組合為菌液接種量5%，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7.0，時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度37℃。測(cè)得此條件下發(fā)酵后粗多糖含量為12.26%，糞腸球菌活菌數(shù)為7.9 109CFU· mL-1。

3　討論

合適的菌液接種量在發(fā)酵工藝優(yōu)化時(shí)十分重要。接種量小，菌體繁殖較慢；接種量過大，則會(huì)因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，導(dǎo)致發(fā)酵菌的生長受到抑制，影響發(fā)酵效果。該試驗(yàn)結(jié)果表明，接種量對(duì)發(fā)酵指標(biāo)的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這與郭舒等的研究報(bào)道一致。

pH值作為影響菌種正常生長繁殖的因素之一，該試驗(yàn)的最適發(fā)酵初始pH值為7.0，這可能由于此pH值條件下，發(fā)酵菌種可以大量正常繁殖，抑制了其他雜菌的生長。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵后益生菌存活率具有十分重要的影響。時(shí)間過短不利于菌種的正常生長繁殖，發(fā)酵也不能充分進(jìn)行；而時(shí)間過長，營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，影響發(fā)酵后活菌數(shù)量，同時(shí)也容易產(chǎn)生酸味過大、顏色過深等現(xiàn)象，因此，發(fā)酵時(shí)間并不是越長越好。

合適的溫度對(duì)益生菌的生長和發(fā)酵十分重要。在適宜的溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵溫度越高，益生菌的生長速率越高，菌體數(shù)量越多，可以降解中草藥基質(zhì)產(chǎn)生更多的多糖；若超過最適培養(yǎng)溫度，則益生菌生長速率小于死亡速率，雜菌的生長加快，不斷消耗基質(zhì)中的多糖，導(dǎo)致基質(zhì)中多糖含量的降低。

該研究利用益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥，不僅使中草藥中有效物質(zhì)最大限度地釋放出來；同時(shí)又在發(fā)酵產(chǎn)物中保留了大量的益生菌，從而可以充分發(fā)揮中草藥和益生菌在動(dòng)物生產(chǎn)上增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力和促進(jìn)動(dòng)物生長的雙重作用，為替代飼用抗生素的研制提供一定的參考。

4　結(jié)論

復(fù)方中草藥最佳發(fā)酵工藝組合為：菌液接種量5%、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.0，時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度37℃。測(cè)得此條件下發(fā)酵后粗多糖含量為12.26%，糞腸球菌活菌數(shù)為7.9 109CFU·mL-1。

S853.73

B

1004-5090201510-0041-03

2015-09-16）

新科工信息［2014］61號(hào)（項(xiàng)目編號(hào)：2014CXY05）

張要齊（1978-）男，漢族，農(nóng)業(yè)推廣碩士，研究方向：獸藥研發(fā)和推廣。