賓冬梅，李玉中，李小林

（衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院，湖南 衡陽 421008）

啤酒糟是生產(chǎn)啤酒的主要原料大米、麥芽等經(jīng)糊化、糖化工藝進行過濾或壓濾之后殘留的固體物質(zhì)，主要成分包括蛋白質(zhì)、纖維組分、維生素、脂肪、礦物質(zhì)及淀粉等[1]，含水量大，容易變質(zhì)。通常，啤酒企業(yè)將啤酒糟直接作為粗飼料銷售，但因其纖維含量高、適口性差，養(yǎng)殖戶不能完全接收[2-5]；另有不少企業(yè)將其作為廢棄物排放，不僅浪費資源，還造成嚴重的環(huán)境污染。為了有效開發(fā)利用啤酒糟，試驗針對其粗纖維和粗蛋白高的營養(yǎng)特點，優(yōu)選出纖維素酶高產(chǎn)菌，將纖維素分解成可供利用的糖類，再經(jīng)酵母菌和枯草芽孢桿菌進行二次混菌發(fā)酵，生產(chǎn)出高微生物蛋白啤酒糟飼料或微生態(tài)制劑，以達到立體開發(fā)啤酒糟的目的。

目前，國內(nèi)外產(chǎn)纖維素酶的主要菌種是曲酶、木霉等[6-10]，世界上纖維素酶市場中的纖維素酶20%是來自木霉屬和曲霉屬[11]。筆者從富含纖維素的土壤中分離和篩選纖維素高效降解曲霉菌株，以啤酒糟為主料，添加不同的C 源和N 源，并調(diào)整其比例，觀察曲霉生長數(shù)目與形態(tài)，從而得出曲霉產(chǎn)纖維素酶活性最高的培養(yǎng)配方研究，以期篩選出發(fā)酵啤酒糟的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試啤酒糟及菌種 試驗所用的啤酒糟取自衡陽市燕京啤酒廠，經(jīng)過干燥、過100 目篩、儲存?zhèn)溆?。在衡陽市郊區(qū)及祁東縣采集富含纖維的稻田土壤樣本，從中提取活性菌種，在實驗室鑒定其為曲霉，作為供試菌種。

1.1.2 試驗儀器 試驗主要儀器有SW-SJ-1F 單人雙面潔凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、DHG-9040A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（寧波江南儀器廠）、FA2004N 電子天平（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）、WHY-2 水域恒溫振蕩器（江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠）、SPX-150BSH-Ⅲ 生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）活化培養(yǎng)基（馬丁氏培養(yǎng)基）：CMC-Na 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏10 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸銨1.5 g/L，瓊脂15 g/L ，pH 值6.0。（2）選擇培養(yǎng)基（以啤酒糟為主料加入C 源或N 源的培養(yǎng)基）：磷酸二氫鉀 0.5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，瓊脂14 g/L，明膠2 g/L，纖維素粉1.88 g/L（預(yù)先經(jīng)1 mol/L 鹽酸冷處理12 h，以水清洗，無鹽酸后用來配置培養(yǎng)基），剛果紅0.2 g/L，pH 值6.0。（3）剛果紅纖維素瓊脂[12]：KH2PO40.5 g/L，MgSO40.25 g/L，瓊脂14 g/L，明膠2 g/L，纖維素粉1.88 g/L（纖維素粉預(yù)先經(jīng)1 mol/L 鹽酸冷處理12 h，以水清洗，無鹽酸后用來配制培養(yǎng)基），剛果紅0.2 g/L，pH 值7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 曲霉的分離與鑒定 將采集的稻田土壤樣本用無菌水混合，充分振蕩，經(jīng)滅菌紗布過濾，靜置，上清液接種于富集培養(yǎng)基中，取富集菌接種到PDA 培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，進行菌株分離，將分離純化得到的菌株活化并配制成孢子懸浮液，分別點接到剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中，重復(fù)3 次，恒溫培養(yǎng)，用十字交叉法測量菌落直徑和透明圈直徑。根據(jù)菌落生長狀態(tài)、透明圈大小、透明圈清晰程度以及菌落和透明圈的比值，篩選菌株。用顯微鏡觀察菌絲及孢子梗形狀，并用油鏡觀察其孢子形態(tài)，參閱《中國真菌志》[13]等進行鑒定。結(jié)果顯示，篩選到的菌株為曲霉，命名曲霉6-3。

1.2.2 最適氮源和碳源的篩選 將曲霉6-3 接種于活化培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)7 d，取10 m L 無菌生理鹽水洗下孢子，加1 滴吐溫80 打散孢子團塊，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度至105～106個/m L。稱取100.00 g 解凍的啤酒糟，分別取10.00 g 置于10個小燒杯中。在此基礎(chǔ)上，分別在小燒杯中添加0.40 g N源（分別為酵母浸液、硫酸銨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素）或碳源（分別為乳糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖），設(shè)置1個空白對照組（CK），對配置好的培養(yǎng)基編號，每個處理重復(fù)2 次。培養(yǎng)基滅菌后接種曲霉6-3，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌種長勢，篩選出促進曲霉6-3 生長的最適碳源和氮源。

1.2.3 氮源和碳源最佳添加量的確定 在篩選的最適碳源和氮源的基礎(chǔ)上，根據(jù)初步試驗結(jié)果[14]，設(shè)定最優(yōu)N 源的添加量分別為3%、4%、5%、6%，最優(yōu)C源的添加量分別為4%、6%、8%、10%。每個處理重復(fù)2 次，根據(jù)菌株長勢確定促進曲霉6-3 生長的最適碳源和氮源的添加量。

1.2.4 氮源和碳源混合的最佳配比 在確定最適碳源和氮源添加量的基礎(chǔ)上，依據(jù)氮碳源的比值3︰5、3︰6、3︰7、4︰5、4︰6、4︰7、5︰5、5︰6、5︰7，將加入的碳氮源與啤酒糟充分混勻。每個處理重復(fù)2次，根據(jù)菌株長勢確定促進曲霉6-3 生長氮碳源的最佳配比。

1.2.5 羧甲基纖維素鈉酶活力的測定 采取3,5-二硝基水楊酸（DNS）顯色法測定葡萄糖標準液的濃度，并繪制曲線，線性方程為y=0.441 4x+0.091 6，R2=0.993 4。啤酒糟發(fā)酵結(jié)束后，取各處理的啤酒糟加100 m L 蒸餾水，于40℃水浴振蕩浸提1 h，脫脂棉過濾，濾液于3 500 r/min 下離心5 min，上清液即粗酶液。在25 m L 具塞試管中加入1.5 m L 以pH 值5.0 檸檬酸緩沖液配制的1% CMC-Na 溶液，置于50 ℃ 水浴中預(yù)熱 5 min。加入0.5 mL 粗酶液酶，搖勻，50℃準確反應(yīng) 40 min，之后加入DNS 試劑1.5 m L，放入沸水浴顯色 5 min，取出后立即置于冰水中冷卻至室溫，定容至 10 m L，搖勻。在波長540 nm 條件下測定其吸光值[14-15]。酶活單位的定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化纖維素水解生成 1 μg 葡萄糖的酶量為1個酶活力單位，用 U/m L 表示。

式中，S 為樣品平均吸光值在標準曲線上對應(yīng)的葡萄糖含量（mg）；D 為定容體積；V 為參與反應(yīng)的粗酶液體積（m L）；T 為反應(yīng)時間（min）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的篩選

2.1.1 最適碳源 由圖1 可知，4種不同的碳源中最能促進曲霉6-3 生長的是乳糖，而蔗糖、淀粉、葡萄糖的促進效果差別不明顯。同時，對比只加氮源和只加碳源的處理，發(fā)現(xiàn)曲霉6-3 在只加入氮源的培養(yǎng)基中有利于菌絲生長，而在只加入碳源的培養(yǎng)基種則有利于孢子產(chǎn)生。

圖1 不同氮源對啤酒糟上曲霉6-3 生長的影響

2.1.2 碳源最佳添加量 試驗結(jié)果顯示，碳源添加量為6%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3 長勢最好，其次是添加量為8%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3 菌株長勢較好，而添加量為4%和10%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3 菌株長勢一般。因此，可以認為碳源的最佳添加量范圍為5%～7%之間。

2.2 氮源的篩選

2.2.1 最適氮源 從圖2 中可以看出，5種氮源中最能促進曲霉6-3 生長的是胰蛋白胨，其次分別是牛肉膏、酵母粉和硫酸銨，促進曲霉6-3 生長效果最不明顯的是尿素。

圖2 不同碳源對啤酒糟上曲霉6-3 生長的影響

2.2.2 氮源最佳添加量 試驗結(jié)果顯示，氮源添加量為4%時，曲霉6-3 的長勢最好，其次是3%和5%的處理，二者的差異不明顯，而添加量為6%的培養(yǎng)基中，曲霉6-3菌株的長勢一般。因此，確定最適氮源——胰蛋白胨的最佳添加量為4%。

2.3 最適碳源和最適氮源的混合比例確定

圖3 不同氮碳源比例對曲霉6-3 生長的影響

由圖3 可知，隨著氮源添加量的增加，曲霉6-3的長勢越來越好，而碳源添加量的增加對曲霉的長勢影響不顯著；其中，碳氮比為4︰7、5︰5、5︰6的處理對曲霉6-3 的生長促進作用差異不明顯，而對曲霉6-3 生長促進作用最差的碳氮比是3︰5，而促進作用最明顯的碳氮比為5︰7。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物中的CMC 酶活力

從表1 中可以看出，碳氮比為 5︰7 的處理，發(fā)酵后啤酒糟的羧甲基纖維素酶活力最高，達188.49 IU，比空白對照處理的高121.2 IU，比其他碳氮比處理的高49.84～57.77 IU；各處理葡萄糖含量也以碳氮比為 5︰7 的處理最高，達0.38 g，是空白對照處理的2.71 倍，比其他碳氮比處理的高35.7%～46.2%。上述結(jié)果與從菌株長勢情況判斷得出的纖維素酶活性結(jié)論一致。同時，試驗結(jié)果也表明在啤酒糟中加入適當?shù)耐庠次镔|(zhì)有利于曲霉產(chǎn)生纖維素酶。

表1 不同碳氮比處理對曲霉6-3 纖維素酶活性的影響

3 結(jié) 論

綜上所述，試驗從富含纖維的土壤中提取到曲霉菌株曲霉6-3，初步篩選出其生長最適的碳源和氮源分別為乳糖和胰蛋白胨，其最佳添加量分別為6%和4%；促進曲霉6-3 生長的最優(yōu)碳氮比為5︰7，發(fā)酵后維素酶活力達188.49 IU，葡萄糖含量為0.38 g。這表明啤酒糟可以作為曲霉的優(yōu)良培養(yǎng)基，對選育優(yōu)良的啤酒糟纖維素分解菌具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]鄧啟華，傅 力，王 德. 啤酒糟成分測定及飼料開發(fā)的研究——蛋白含量及纖維組分的分析[J]. 啤酒科技，2008，（12）：52-54.

[2]孫丹鳳，王友煒，王 聰. 發(fā)酵啤酒糟營養(yǎng)價值評定及對肉雞生長性能的影響[J]. 飼料工業(yè)，2009，（17）：26-28.

[3]王 冰，方熱軍. 酶解發(fā)酵啤酒糟在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 廣東飼料，2011，（8）：41-42.

[4]蔡 俊. 啤酒糟發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2001，（3）：30-31.

[5]郭素環(huán)，周碧君，文 明，等. 酒糟生物飼料對肉牛育肥及免疫功能的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2013，（14）：126-129.

[6]杜先林，李 輝，王義強，等. 里氏木霉Rut-30 產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2010，（9）：112-119.

[7]劉小杰. 康氏木霉ZJ5 纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 浙江大學學報（工學版），2003，（5）：127-132.

[8]王儀明. 綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力的研究[J]. 草業(yè)科學，2009，（5）：123-127.

[9]李燕紅，趙輔昆. 纖維素酶的研究進展[J]. 生命科學，2005，（5）：20-25.

[10]王洪媛，范丙全. 三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果[J]. 微生物學報，2010，（7）：870-875.

[11]魏亞琴，李紅玉. 纖維素酶高產(chǎn)菌選育研究進展及未來趨勢[J]. 蘭州大學學報（自然科學版），2008，（1）：107-115.

[12]王淑軍，楊從發(fā)，陳 靜. 用于降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選研究[J]. 糧食與飼料工業(yè)，2001，（12）：21-23.

[13]孔華忠. 中國真菌志[M]. 北京：科學出版社，2007. 54-56.

[14]Coward-Kelly G，Aiello-M azzari C， Kim S， et al. Suggested improvements to the standard filter paper assay used to measure cellulase activity[J]. Biotechnology and Bioengineering，2003，82（6）：745-749.

[15]許玉林，鄭月霞，葉冰瑩，等. 一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學通報，2013，（2）： 220-227.