趙志蓮等

摘要：以大理州不同居群滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）、同一居群不同植株為試驗(yàn)材料，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷的含量進(jìn)行測(cè)定；再以龍膽苦苷含量≥7.0 %的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源為外植體，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH及培養(yǎng)溫度對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)植株再生的影響。結(jié)果表明，大理州6個(gè)居群滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量較高，不同居群間龍膽苦苷含量具有顯著差異（P<0.05），以鶴慶縣居群的龍膽苦苷含量最高（80.70 mg/g），含量最低的巍山縣居群也超過(guò)國(guó)家藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的2倍多；同一居群內(nèi)不同植株滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量差異較小，只有云龍縣居群不同植株間具有顯著差異（P<0.05），其他居群不同植株間無(wú)顯著差異（P>0.05）；滇龍膽生長(zhǎng)點(diǎn)離體培養(yǎng)及植株再生最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是1/2MS+30 g/L蔗糖+pH 5.2+20 ℃/25 ℃變溫培養(yǎng)，再生植株誘導(dǎo)率最高可達(dá)88.9%，試驗(yàn)初步建立了滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生體系。

關(guān)鍵詞：滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）；種質(zhì)資源；龍膽苦苷；離體培養(yǎng)；植株再生

中圖分類號(hào)：S567.23+9；S502.4；Q946.83 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4228-04

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）是龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬[Gentiana（Tourn.）L.]多年生草本植物，別名堅(jiān)龍膽、龍膽草、蘭花根、青魚(yú)膽等，主要分布在云南、貴州、四川等省[1]，為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)三級(jí)野生藥材瀕危物種。滇龍膽是傳統(tǒng)中藥龍膽的重要基源植物，以根及根莖入藥，具有清熱瀉火、保肝健脾、消炎殺菌等作用[2]。最新藥理學(xué)研究表明，滇龍膽還具有抗呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）、降血糖等功效[3，4]。

研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，滇龍膽根及根莖中主要活性成分龍膽苦苷的含量因產(chǎn)地不同而存在較大的差異，云南省不同產(chǎn)地的滇龍膽其根及根莖中龍膽苦苷的含量在2.75%～4.87%，全省滇龍膽的龍膽苦苷含量平均為4.77%；其中大理白族自治州的洱源、巍山、劍川縣所產(chǎn)滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷的含量分別為7.02%、6.02%、5.35%，顯著高于尋甸縣所產(chǎn)滇龍膽的龍膽苦苷含量（3.85%）以及昆明市所產(chǎn)滇龍膽的龍膽苦苷含量（2.45%）。由此可見(jiàn)，大理州所產(chǎn)滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于《中國(guó)藥典》中1.5%[8]的限量標(biāo)準(zhǔn)，所以有必要以根及根莖中龍膽苦苷含量為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大理州滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，并建立滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源離體培養(yǎng)及植株再生體系。為此，試驗(yàn)采用高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)大理州范圍內(nèi)所產(chǎn)滇龍膽野生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，再以活性成分龍膽苦苷含量較高的野生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源為外植體，在植物組織培養(yǎng)基中不添加任何植物激素的條件下，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法研究培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH及培養(yǎng)溫度對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的影響，以期為滇龍膽野生優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源篩選、離體保存、快速繁殖、資源可持續(xù)利用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣點(diǎn)選擇與樣品采集 2011年9～11月，分別在云南省大理州的大理市、劍川縣、鶴慶縣、巍山彝族回族自治縣、云龍縣、洱源縣等滇龍膽的主要原料來(lái)源地采集野生居群?jiǎn)沃辏骶尤洪g距離100 km，株距不小于3 m，6個(gè)居群各隨機(jī)采集30株，自然干燥。滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生外植體為大理市居群12～2月分化的休眠芽生長(zhǎng)點(diǎn)。

1.1.2 儀器與試劑 儀器主要有美國(guó)惠普公司Agilent1100高效液相色譜儀（包括G1313A ALS自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315A/B DAD 檢測(cè)器、Agilent ChemStation色譜工作站）、梅特勒-托利多AE240分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司]、SK5200H型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）、FY135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、Millipore純水處理系統(tǒng)[默克化工技術(shù)（上海）有限公司]、BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）以及人工智能氣候箱；高壓滅菌器；無(wú)菌操作臺(tái)等。試劑主要有中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770-200510），高效液相用甲醇為色譜純，高效液相用水為三重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.1.3 樣品的選擇 在滇龍膽不同居群根及根莖中龍膽苦苷含量測(cè)定時(shí)，從每個(gè)居群中隨機(jī)選取根及根莖質(zhì)量為6.0～6.6 g的植株9株混合后作為樣品。在滇龍膽同一居群不同植株根及根莖中龍膽苦苷含量測(cè)定時(shí)，以龍膽苦苷含量較高的4個(gè)居群為研究對(duì)象，從每個(gè)居群中隨機(jī)選取根及根莖質(zhì)量為6.0～6.6 g的植株5株作為樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品中龍膽苦苷含量測(cè)定 所有樣品經(jīng)過(guò)粉碎、過(guò)100目篩、混合均勻，按照前期建立的方法[9]提取與測(cè)定龍膽苦苷的含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。龍膽苦苷含量用龍膽苦苷質(zhì)量/干物質(zhì)質(zhì)量表示。

1.2.2 滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生 滇龍膽外植體處理及接種方法按照前期建立的方法[9]完成。采用L9（34）正交試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)因子水平，分別設(shè)培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH和培養(yǎng)溫度4個(gè)因子，每個(gè)因子取3個(gè)水平，基本培養(yǎng)基為MS（含瓊脂8 g/L），各因子水平組合見(jiàn)表1。培養(yǎng)容器為250 mL玻璃三角瓶，每瓶加入50 mL培養(yǎng)基，120 ℃高壓滅菌15 min，冷卻后每瓶接種6個(gè)外植體，每個(gè)處理接種5瓶，設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行設(shè)置，光照度為27 μmol/（m2·s），光照時(shí)間為16 h/d。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)（接種外植體中有芽生成的外植體數(shù)），計(jì)算誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率為出芽數(shù)占接種外植體數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表述為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽居群間及居群內(nèi)植株根及根莖中龍膽苦苷含量比較

2.1.1 不同居群的根及根莖中龍膽苦苷含量 試驗(yàn)測(cè)定得到的龍膽苦苷對(duì)照品及試驗(yàn)樣品的色譜圖見(jiàn)圖1，不同居群的根及根莖中龍膽苦苷含量情況見(jiàn)表2。在對(duì)大理州6個(gè)不同居群滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量的比較分析后發(fā)現(xiàn)，大理州所產(chǎn)滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量整體較高，均高于《中國(guó)藥典》中1.5%[8]的限量標(biāo)準(zhǔn)。其中，含量較低的巍山縣居群和劍川縣居群就分別達(dá)到了42.87、57.33 mg/g，而鶴慶縣居群滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量高達(dá)80.70 mg/g，顯著高于其他5個(gè)居群（P<0.05）；大理市、云龍縣、洱源縣3個(gè)居群之間滇龍膽根及根莖中的龍膽苦苷含量（分別為73.30、72.27、72.40 mg/g）差異不顯著（P>0.05），但也顯著高于巍山縣居群和劍川縣居群（P<0.05）。研究結(jié)果表明，大理州的6個(gè)野生滇龍膽居群之間根及根莖中龍膽苦苷含量具有差異分化，在野生滇龍膽中存在龍膽苦苷含量較高的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，這為從野生滇龍膽居群中篩選根及根莖中龍膽苦苷含量較高的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供了依據(jù)。

2.1.2 同一居群不同植株的根及根莖中龍膽苦苷含量 大理州野生滇龍膽在大理市、洱源縣、鶴慶縣、云龍縣4個(gè)居群內(nèi)不同植株的根及根莖中龍膽苦苷含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)表3數(shù)據(jù)比較分析可知，大理市、洱源縣、鶴慶縣3個(gè)居群內(nèi)植株之間的滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量差異不顯著（P>0.05），僅云龍縣居群的植株間龍膽苦苷含量存在顯著差異（P<0.05），說(shuō)明滇龍膽同一居群內(nèi)各植株的根及根莖中龍膽苦苷含量具有較穩(wěn)定的居群遺傳能力，可以把從野生滇龍膽居群中篩選出的根及根莖中龍膽苦苷含量較高的優(yōu)勢(shì)居群作為繁殖及育種材料使用。

2.2 滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的結(jié)果

2.2.1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的影響 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可見(jiàn)，當(dāng)試驗(yàn)因素水平組合為MS培養(yǎng)基+蔗糖20 g/L+pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃時(shí)，滇龍膽離體培養(yǎng)接種外植體芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了84.4%。對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH是滇龍膽離體培養(yǎng)誘導(dǎo)芽的主要影響因素，對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率的影響較大，而培養(yǎng)基類別和蔗糖濃度對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率的影響較小。綜合各因子分析結(jié)果，得出滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的最佳組合是A2B3C1D3，即培養(yǎng)基類別為 1/2 MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+ pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃；用此組合方法對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果芽誘導(dǎo)率達(dá)到了88.9%，與試驗(yàn)結(jié)果相近，證明L9（34）正交試驗(yàn)所得結(jié)果具備客觀有效性，可以作為滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)方法。

2.2.2 方差分析 為了進(jìn)一步了解試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因子之間在滇龍膽離體培養(yǎng)促進(jìn)效果方面的差異，又對(duì)試驗(yàn)結(jié)果芽誘導(dǎo)率進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，因子D（培養(yǎng)溫度）對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率產(chǎn)生的作用達(dá)到了極顯著差異水平（P<0.01），因子C（pH）對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)率的作用達(dá)到了顯著差異水平（P<0.05），而因子A（培養(yǎng)基種類）和因子B（蔗糖濃度）對(duì)滇龍膽離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)的作用不顯著（P>0.05）。綜合各因子的表現(xiàn)，得出滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的最佳組合是A2B3C1D3，即培養(yǎng)基種類為1/2MS+蔗糖濃度30 g/L+pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，大理州范圍內(nèi)滇龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量整體較高，滇龍膽不同居群間龍膽苦苷含量具有顯著差異（P<0.05），其中，鶴慶縣居群龍膽苦苷含量顯著高于其他居群，含量最低的巍山縣居群中龍膽苦苷含量也是《中國(guó)藥典》2010年版1.5%[8]限量標(biāo)準(zhǔn)的2倍多。滇龍膽同一居群不同植株根及根莖中龍膽苦苷含量差異較小，大理市、洱源縣、鶴慶縣3個(gè)居群內(nèi)不同植株間龍膽苦苷含量差異不顯著（P>0.05），云龍縣居群內(nèi)不同植株間龍膽苦苷含量具有顯著差異（P<0.05），說(shuō)明滇龍膽同一居群內(nèi)不同植株根及根莖中龍膽苦苷含量具有較穩(wěn)定的居群遺傳能力，這個(gè)研究結(jié)果與楊維澤等[10]的研究結(jié)果相似，滇龍膽居群間表型變異高于居群內(nèi)的表型變異。證明大理州范圍內(nèi)存在龍膽苦苷含量較高的野生滇龍膽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，野生滇龍膽居群間龍膽苦苷含量差異較大，居群內(nèi)龍膽苦苷含量差異較小。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是開(kāi)展珍稀瀕危藥用植物資源保護(hù)、離體培養(yǎng)及植株再生研究的有效途徑。試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中不添加任何植物激素的條件下，不同組合的培養(yǎng)基、蔗糖濃度、pH及培養(yǎng)溫度處理均能誘導(dǎo)滇龍膽莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)再生植株，優(yōu)選出滇龍膽離體培養(yǎng)及植株再生的最佳培養(yǎng)組合條件是培養(yǎng)基種類為1/2MS+蔗糖濃度30 g/L+pH 5.2+培養(yǎng)溫度20 ℃/25 ℃。而朱宏濤等[11]、羅春梅等[12]及張潔等[13]的研究都在培養(yǎng)基中添加了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，滇龍膽外植體經(jīng)過(guò)愈傷組織途徑后再完成植株再生，與本研究的植株再生方式不一樣。因此，滇龍膽離體培養(yǎng)再生植株根及根莖中龍膽苦苷含量較高的性狀是否能夠得到穩(wěn)定遺傳？同時(shí)本研究?jī)H建立了大理州滇龍膽居群離體培養(yǎng)及植株再生體系，在此培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下是否能建立其他居群的離體培養(yǎng)及植株再生體系等，都還需要經(jīng)過(guò)下一步的試驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志（第62卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1988.100-101.

[2] 莊緒會(huì)，孫 嬌，張慶芝.昆明龍膽與滇龍膽中龍膽苦苷含量的比較[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33（1）：12-13，23.

[3] GAO L J， XIANG L，LUO Y， et al. Gentisides C-K： Nine new neuritogenic compounds from the traditionaL Chinese medicine Gentiana rigescens Franch[J]. Bio & Med Chemi，2010， 18： 6995-7000.

[4] ANONYMOUS. Natural product research； Research on natural product research discussed by scientists at harbin medical university[J].China Weekly News，2011，8（16）：60-65.

[5] 來(lái)國(guó)防，程 賓，羅士德，等.云南不同產(chǎn)地滇龍膽中龍膽苦苷的含量測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（8）：1867-1868.

[6] 李智敏，趙 磊，白艷婷，等.不同產(chǎn)地滇龍膽中龍膽苦苷的含量測(cè)定[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，6（12）：10-11，14.

[7] 李智敏，劉 莉，李晚誼，等.滇龍膽的藥用資源研究與開(kāi)發(fā)進(jìn)展[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，31（S1）：485-487.

[8] 中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典編纂委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.89.

[9] 趙志蓮，李海峰，張德全，等.滇龍膽種質(zhì)資源篩選及離體培養(yǎng)的初步研究[J].北方園藝，2013（8）：168-172.

[10] 楊維澤，金 航，楊美權(quán)，等.云南滇龍膽居群表型多樣性及其與環(huán)境關(guān)系研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（7）：1886-1890.

[11] 朱宏濤，陳可可，張穎君，等.堅(jiān)龍膽的快速繁殖[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2004，11（3）：25-27.

[12] 羅春梅，邱 璐，劉愛(ài)民.不同激素組合對(duì)誘導(dǎo)滇龍膽頂芽及腋芽產(chǎn)生不定芽的研究[J].楚雄師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20（3）：49-52.

[13] 張 潔，劉紅美.貴州產(chǎn)堅(jiān)龍膽組織培養(yǎng)體系的建立[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（17）：4250-4252.