曾建剛，孫化鵬，阮琴妹，程建宇，鐘曉紅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙410128）

洋常春藤（Hedera helix）為五加科常春藤屬的一種多年生常綠攀援藤本植物，全株可入藥[1]。現(xiàn)階段研究表明其主要功能成分是皂苷類化合物[2]。該類化合物具有保肝、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、止痛等多種藥理活性[3-5]。歐洲藥典和英國(guó)藥典均已收錄洋常春藤作為植物藥，其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是洋常春藤干燥葉片中常春藤皂苷C 的含量不低于3%[6-8]。洋常春藤在我國(guó)分布廣泛，目前國(guó)內(nèi)對(duì)洋常春藤的研究主要集中在培育、繁殖等方面[9-10]，而對(duì)于其功能成分的研究甚少，使得洋常春藤資源的利用率不高。因此，加快洋常春藤功能成分的深入研究和開發(fā)，提高洋常春藤的綜合利用價(jià)值，對(duì)于豐富我國(guó)藥用植物的研究具有十分深遠(yuǎn)的意義。

近年來國(guó)內(nèi)多采用均勻設(shè)計(jì)或正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化植物有效成分的提取工藝，這兩種設(shè)計(jì)方法均采用線性數(shù)學(xué)模型，雖然簡(jiǎn)便、試驗(yàn)次數(shù)少，但其精度不高。星點(diǎn)設(shè)計(jì)（CCD）[11-12]是在析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上采取非線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合分析，其復(fù)相關(guān)系數(shù)相對(duì)較高，預(yù)測(cè)值更精確，并具有試驗(yàn)次數(shù)較少、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)采用CCD 法，并結(jié)合效應(yīng)面法優(yōu)化洋常春藤皂苷C 的提取工藝，為洋常春藤皂苷C 的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：洋常春藤鮮葉于2014年8月采自湖南省長(zhǎng)沙市，洗凈后置于鼓風(fēng)干燥箱中60℃烘干至恒重，粉碎后過60 目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：乙腈、磷酸為色譜純，乙醇為分析純，超純水（自制）。常春藤皂苷C 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購(gòu)于南京春秋生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu 高效液相色譜儀，包括Shimadzu SPD20A 檢測(cè)器、Shimadzu SIL20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、Shimadzu L C Solutions 工作站；數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；AL204 電子天平（梅特勒–托利多上海有限公司）；高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制造機(jī)械有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HPLC 法測(cè)定常春藤皂苷C 含量 具體步驟如下：

（1）HPLC 檢測(cè)法色譜條件的選擇。選擇C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)。二元高壓梯度洗脫：0～35 m in，20%～50%A；35～40 m in，50%～60%A。檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1.0 m L/m in，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25℃。

（2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取常春藤皂苷C標(biāo)準(zhǔn)品5.1 mg，甲醇溶解定容至5 m L，配成濃度為1.02 mg/m L 的儲(chǔ)備液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。分別將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用甲醇稀釋1、2、3、4、5 倍，搖勻，按（1）項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)品常春藤皂苷C 的濃度（mg/m L）為橫坐標(biāo)，以色譜的峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制常春藤皂苷C濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）常春藤皂苷C 含量的測(cè)定。取制備好的樣品溶液，按（1）項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出常春藤皂苷C 的含量，從而計(jì)算常春藤皂苷C得率。

1.3.2 提取工藝的優(yōu)化 通過單因素試驗(yàn)和星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行模型擬合與數(shù)據(jù)處理，以提取優(yōu)化的工藝。

（1）單因素試驗(yàn)。精密稱取洋常春藤粉末3.0 g 于200 m L圓底燒瓶中，加入60 m L 一定濃度的乙醇，選取50℃、60℃、70℃、80℃、90℃不 同 水 浴 溫 度；10 m in、20 m in、40 m in、60 m in、80 m in 不同提取時(shí)間；1、2、3、4、5 不同提取次數(shù)；30%、45%、60%、75%、90%不同乙醇濃度進(jìn)行回流提取，過濾，合并濾液，按1.3.1（4）的方法測(cè)定常春藤皂苷C 的含量，并計(jì)算出常春藤皂苷C 的得率。

（2）星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。為了更精確地研究各因素的最佳水平值，在單因素試驗(yàn)結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，取回流溫度（x1）、乙醇濃度（x2）、提取時(shí)間（x3）作為自變量，設(shè)定因素水平表，見表1。因提取次數(shù)為非連續(xù)的變量，不能夠進(jìn)行回歸處理，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)際，均設(shè)定為兩次。稱取常春藤粉末3.0 g 于200 m L圓底燒瓶中，加入60 m L 一定濃度的乙醇，置于水浴鍋中回流提取，過濾，合并濾液，HPLC 法測(cè)定溶液中常春藤皂苷C 含量。

（3）模型擬合與數(shù)據(jù)處理。本實(shí)驗(yàn)使用Design–Expert 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用效應(yīng)面分析方法，進(jìn)行多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合，并對(duì)擬合出的較優(yōu)方程模型進(jìn)行方差分析。以擬合方程的r 和P 值為指標(biāo)，選擇P 和r 較佳的方程作為模型。依據(jù)模型方程來繪制響應(yīng)面三維立體圖及等高線。因?yàn)樾?yīng)曲面圖為三維圖，只能表示出其中兩個(gè)自變量的函數(shù)，所以，分別固定3個(gè)自變量中的一個(gè)為中值，在擬合目標(biāo)函數(shù)的基礎(chǔ)上，繪制因變量三維立體效應(yīng)面圖。利用該效應(yīng)面三維圖對(duì)任意2個(gè)自變量的交互作用進(jìn)行分析及評(píng)價(jià)。利用Design-Expert 8 軟件中Optimization模塊的Point Prediction 功能分析預(yù)測(cè)最佳提取工藝條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終得出常春藤皂苷C 的最佳提取工藝條件。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 常春藤皂苷C 的HPLC 檢測(cè)法的建立

通過不斷調(diào)整流動(dòng)相比例，在1.3.1（1）項(xiàng)下二元高壓梯度洗脫時(shí)，樣品溶液色譜圖基線平穩(wěn)，不同組分分離度較好，由此確定常春藤皂苷C 的HPLC 檢測(cè)法的色譜條件。

得常春藤皂苷C 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=1.7×106X-7 972.3，R2=0.999 3。結(jié)果表明，常春藤皂苷C 的濃度與峰面積線性關(guān)系良好，HPLC 法測(cè)定常春藤皂苷C 的含量有效可行。

2.2 提取工藝的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1，由圖1 可知，常春藤皂苷C 提取的最佳單因素實(shí)驗(yàn)條件為：回流溫度70℃，乙醇濃度75%，提取時(shí)間70 min，提取次數(shù)由于2 次后變化不大，考慮工業(yè)生產(chǎn)成本和實(shí)際，均定為2 次。在上述最佳單因素條件下，常春藤皂苷C 最佳得率為3.51%。

2.2.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素范圍。由于非連續(xù)變量不能夠進(jìn)行回歸處理，綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際，提取次數(shù)均設(shè)定為2 次，星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.3 模型擬合與效應(yīng)面分析

（1）模擬方程。用Design–Expert 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以因變量分別對(duì)自變量進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合。所得常春藤皂苷C 得率的線性回歸方程為：

y=2.685 51＋0.004 22x1＋0.003 16x2＋0.002 89x3(r=0.135 4，P>0.05)。擬合度較差，模型不合格，因此多元線性模型不合適。

圖1 溫度（A）、乙醇濃度(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)對(duì)常春藤皂苷C 提取得率的影響

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

得到常春藤皂苷C 得率非線性二次方程為：

y=－0.477 28＋0.019 985x1＋0.092 326x2＋0.011 827x3＋3.64×10-6x1x2－6.20×10-6x1x3＋9.06×10-5x2x3－1.21×10-4x12－7.79×10-4x22－1.55×10-4x32(r=0.984 5，P＜0.01)

由上述方程可知，二項(xiàng)式方程的r 值要高于線性方程，且P＜0.01，表明二項(xiàng)式方程具有高度的顯著性，模型與實(shí)際擬合較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)來優(yōu)化常春藤皂苷C 的提取是可行的。對(duì)二項(xiàng)式方程的回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，方程的一次項(xiàng)對(duì)常春藤皂苷C 得率的線性效應(yīng)均表現(xiàn)為極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)中，各個(gè)因素對(duì)常春藤皂苷C 得率的曲面效應(yīng)影響均顯著；其中x2x3的P＜0.05，說明乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用顯著，其他因素間的交互作用不顯著。

（2）效應(yīng)面分析。根據(jù)二項(xiàng)式方程，固定3個(gè)自變量之一為中值，應(yīng)用Design–Expert 8 軟件作三維效應(yīng)面圖（圖2～圖4），由圖2～圖4 可以看出，3個(gè)因素對(duì)常春藤皂苷C 得率的影響順序是：乙醇濃度>提取時(shí)間>回流溫度。乙醇濃度與提取時(shí)間這2個(gè)因素間的交互作用顯著，回流溫度與乙醇濃度、提取時(shí)間之間的交互作用影響不顯著。常春藤皂苷C 得率的較佳工藝范圍為乙醇濃度60%～70%，回流溫度70～85℃，提取時(shí)間45～60 m in。通過軟件分析，得出回歸模型的最大值點(diǎn)，即常春藤皂苷C 的最佳提取工藝條件為乙醇濃度62.6%，回流溫度82.3℃，提取時(shí)間54.7 m in，回流提取2 次。在此條件下，常春藤皂苷C的預(yù)測(cè)得率為3.56%。

表3 擬合二項(xiàng)式方程方差分析

圖2 乙醇濃度與回流溫度對(duì)常春藤皂苷C 得率的效應(yīng)面圖

圖3 提取時(shí)間與回流溫度對(duì)常春藤皂苷C 得率的效應(yīng)面圖

圖4 提取時(shí)間與乙醇濃度對(duì)常春藤皂苷C 得率的效應(yīng)面圖

（3）優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證。按照得出的最佳提取工藝條件進(jìn)行5 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，最佳工藝提取的常春藤皂苷C 得率的平均值為3.52%。其結(jié)果與擬合方程的預(yù)測(cè)值3.56%較吻合，偏差值為0.04個(gè)百分點(diǎn)。表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，由數(shù)學(xué)模型所得的最佳條件與設(shè)計(jì)目標(biāo)相符合。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)- 效應(yīng)面法得出了回流溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)常春藤皂苷C 的效應(yīng)趨勢(shì)，優(yōu)化了常春藤皂苷C 的提取工藝。充分考慮到了各因素間的交互作用，設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)便，精度高，試驗(yàn)次數(shù)少。并且此方法模型擬合的復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，可信度好，結(jié)果直觀，便于分析。經(jīng)過驗(yàn)證，該方法優(yōu)化常春藤皂苷C 提取準(zhǔn)確可行。

通過回歸分析和驗(yàn)證，得到常春藤皂苷C 最佳提取工藝條件乙醇濃度62.6%，回流溫度82.3℃，提取時(shí)間54.7 min，回流提取2 次。在此條件下，常春藤皂苷C 的得率為3.52%，該得率比單因素實(shí)驗(yàn)中最佳得率更高，且提取成本降低，說明方程模型有較好的應(yīng)用價(jià)值。利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化常春藤皂苷C提取是有效可行的。該研究可為常春藤皂苷C 的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)，有效提高原料利用率。

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