顧佳瑛 薛超波 宋蓉 林昕 管峰

摘 要：為了評(píng)測(cè)物種鑒定PCR體系的特異性及其影響因素，實(shí)驗(yàn)對(duì)豬源性成分鑒定相關(guān)的7對(duì)引物就退火溫度、鎂離子濃度和不同Taq酶的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，退火溫度和鎂離子濃度對(duì)PCR特異性有著重要影響，而其中2對(duì)引物優(yōu)化后仍與鼠、兔、牛、羊、雞和鴨有非特異性擴(kuò)增。不同的Taq酶對(duì)引物特異性也有重要影響，本實(shí)驗(yàn)中r Taq酶在7對(duì)引物PCR體系中特異性最佳。通過對(duì)引物體系的優(yōu)化和選擇不同的Taq酶，可以有效提高特異性，減少非特異性擴(kuò)增，為建立物種鑒定的PCR體系及多重PCR提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；物種鑒定；引物；特異性評(píng)測(cè)

中圖分類號(hào) S828.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）17-121-04

Assessment and Determination of Specificity of Seven Pairs of Primers for Porcine Identification

Gu Jiaying1 et al.

（1College of Life Science，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

Abstract：To assess and determine the specificity of PCR system for species identification，seven pairs of primers for porcine identification were used to assess the effects of annealing temperature，concentration of MgCL2 and different Taq DNA polymerase on PCR specificity in this study. The results showed that there had two of seven pairs of primers had nonspecific amplification with rat，rabbit，bovine，ovine and chicken after optimization of PCR conditions. After PCR conditions were optimized for each pair of primers，including annealing temperature，concentrations of MgCL2 and dNTP，different Taq DNA polymerases. The PCR specificity was improved but not significantly. The results indicated that rTaq polymerase enzyme performed best to ensure the specificity of seven pairs of primers. This study could provide some guidance for development multiplex PCR methods of species identification.

Key words：Pig；Species identification；Primer；Specificity assessment

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，肉類已經(jīng)成為人們食品來源的重要組成部分，現(xiàn)代肉類加工業(yè)及食品行業(yè)的快速發(fā)展更是促進(jìn)了肉類食品多樣化的快速發(fā)展。肉類食品摻假問題一直是大家非常關(guān)注的話題，由于近幾年來各種“假羊肉”和歐洲馬肉風(fēng)波等多個(gè)制假摻假肉類事件屢禁不止，消費(fèi)者對(duì)肉類質(zhì)量與安全性的關(guān)注和要求也越來越高。盡管世界各國(guó)都在加強(qiáng)對(duì)肉食品的監(jiān)管監(jiān)督，但世界范圍內(nèi)的食品摻假仍然有不斷增加的趨勢(shì)，在一定程度上影響了消費(fèi)者對(duì)食品行業(yè)的信心。近些年來，我國(guó)查處了多起用廉價(jià)的或者不合格的豬肉、雞鴨肉甚至狐貍?cè)獾让俺渑Ｑ蛉庵破吩谑袌?chǎng)銷售事件。肉類摻假問題不僅損害消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益，更重要的是可能危害消費(fèi)者的身體健康，甚至?xí)硪恍┳诮绦叛龅壬鐣?huì)問題，因此，對(duì)肉類摻假的檢測(cè)就顯得尤為重要。另外，牛羊的肉骨粉由于“瘋牛病”的潛在隱患，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織明令禁止的[1]。在檢測(cè)方面，國(guó)內(nèi)外制定了諸多對(duì)于常見肉類的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)也有牛羊豬等物種成分的檢測(cè)方法[2-5]，但大部分動(dòng)物源性成分鑒定的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)存在諸如檢測(cè)效率低、對(duì)于未知物種無法檢測(cè)、對(duì)儀器要求高等不足，在檢測(cè)應(yīng)用的同時(shí)無疑增加了檢測(cè)成本。

在物種鑒定方法發(fā)展過程中，基因組DNA尤其是線粒體DNA（mtDNA）由于具有穩(wěn)定性好、不受組織來源和外在形態(tài)等影響的特點(diǎn)，逐漸成為了DNA分析技術(shù)中的首選靶標(biāo)，也是當(dāng)今“DNA條形碼”技術(shù)的首選靶標(biāo)。如今，PCR及其衍生技術(shù)作為DNA檢測(cè)的主要手段被廣泛應(yīng)用，而引物的特異性和試劑是影響PCR特異性的主要因素[6-8]。多重PCR技術(shù)在物種鑒定中具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)越性，但多重PCR體系也對(duì)引物的特異性和體系的穩(wěn)定性提出了更高的要求。為了評(píng)測(cè)PCR體系特異性的影響，本研究對(duì)豬源性成分鑒定相關(guān)的6對(duì)和1對(duì)自行設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行了特異性和影響因素評(píng)測(cè)，探究PCR特異性的影響因素，為建立多重PCR提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑 牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、牛蛙、魚（鯽魚和小黃魚）均購(gòu)自超市肉類專柜；兔肉、水牛血樣和小鼠肝臟為實(shí)驗(yàn)室保存的研究樣品。按照動(dòng)物組織或血液DNA提取試劑盒指導(dǎo)提取基因組DNA，用TE溶解后放4℃?zhèn)溆?。r Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司、Easy Taq DNA Polymerase購(gòu)自TRANS公司、Dream Taq酶購(gòu)自Fermentas公司，DNA Taq酶和高保真Taq酶購(gòu)自Thermofisher公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)常用分子生物學(xué)試劑。DNA提取后用NanoDrop 2000 UV-Visspectrophotometer進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，測(cè)定濃度和A260/280值。

1.2 引物設(shè)計(jì) 本研究選用了6對(duì)來自文獻(xiàn)與豬檢測(cè)相關(guān)的引物和1對(duì)自己設(shè)計(jì)的豬源性成分特異性鑒定引物，引物序列和文獻(xiàn)來源等信息見表1。

表1 豬的檢測(cè)引物信息

[引物

編號(hào)＼&基因序列

（5′-3′）＼&檢測(cè)

對(duì)象＼&文獻(xiàn)

來源＼&引物

對(duì)I＼&GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA＼&豬＼&[5，9，10]＼&ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG＼&引物

對(duì)II＼&AATTTTTGGGGATGCTTAGACT＼&豬＼&[11]＼&TATTTTGGGAGGTTATTGTGTTGTA＼&引物

對(duì)III＼&GAAAAATCATCGTTGTACTTCAACTACA＼&豬＼&[12，13]＼&GGTCAATGAATGCGTTGTTGAT＼&引物

對(duì)IV＼&CTGGTCTTGTAAACCAGA＼&豬、牛、

羊＼&[14]＼&CCATCGAGATGTCTTATTTAAGAGG＼&引物

對(duì)V＼&CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA＼&豬＼&[15]＼&GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA＼&引物

對(duì)VI＼&ACGCCAATCTACCACAAA＼&豬＼&自己設(shè)計(jì)＼&TGGCTGGCACGAGATTTA＼&引物

對(duì)VII＼&AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA＼&多物種＼&[16，17]＼&GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA＼&]

1.3 PCR參考條件及特異性評(píng) 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PCR條件，在既定條件下測(cè)試PCR體系對(duì)于物種DNA的非特異性擴(kuò)增情況，依此評(píng)測(cè)引物的特異性，具體PCR體系和程序參閱表1各文獻(xiàn)。引物對(duì)VI的反應(yīng)體系為20μL，其中Buffer緩沖液2.0μL，上下游引物各2.0μL，dNTP 1.6μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，MgCl2 1.6μL，DNA模板3.0μL（約含30ng DNA），ddH2O補(bǔ)充至20.0μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃變性5min；95℃變性30s，退火58.5℃、30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；然后72℃保持5min。其測(cè)試所用DNA模板包括水牛、奶牛、山羊、綿羊、鹿、雞、鴨和魚類。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后使用凝膠成像儀進(jìn)行觀察。經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得目標(biāo)產(chǎn)物與預(yù)期大小一致且條帶清晰則認(rèn)為特異性好，反之亦然。

1.4 PCR條件優(yōu)化及特異性檢測(cè) 針對(duì)如上7對(duì)引物，按照20μL的PCR體系，進(jìn)行退火溫度（45～65℃）、MgCL2濃度（1.5～3.0mM）、引物濃度（0.05～1μM）和dNTP濃度的優(yōu)化，豬DNA模板添加量固定為約30ng。條件優(yōu)化后同樣以水牛、奶牛、山羊、綿羊、鹿、雞、鴨和魚類的DNA為模板，測(cè)試PCR體系的特異性。

1.5 不同DNA聚合酶對(duì)PCR體系特異性的影響 為篩選特異性好且成本較低的試劑材料，用優(yōu)化后的PCR體系對(duì)7對(duì)引物使用不同的DNA Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選Taq酶與PCR體系的組合，所用Taq酶包括r Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶、Easy Taq DNA Polymerase、Dream Taq酶、EX Taq酶、Easy Taq DNA Polymerase和Thermofisher公司的DNA Taq酶以及高保真Taq酶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA檢測(cè) 對(duì)提取的基因組DNA檢測(cè)結(jié)果表明，濃度在80～220ng/μL，A260/280在1.78～2.08，電泳條帶有部分拖尾現(xiàn)象。

2.2 固有條件下特異性檢測(cè)結(jié)果 按照文獻(xiàn)報(bào)道的PCR體系和反應(yīng)程序，使用Takara公司的EX Taq酶對(duì)各引物PCR體系特異性評(píng)測(cè)。其中引物對(duì)I可以特異性擴(kuò)增豬基因組DNA，產(chǎn)物大小為212bp，且條帶清晰，對(duì)羊、雞、鴨、鼠、兔DNA沒有非特異擴(kuò)增，但是對(duì)牛DNA有非特異性擴(kuò)增。引物對(duì)II對(duì)豬DNA有特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為712bp，與牛、羊、雞、鴨、鼠、兔DNA沒有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物（如圖1所示）。引物對(duì)III雖然也可以特異性擴(kuò)增豬DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100bp，但與牛、羊、雞、鴨、鼠、兔DNA都有非特異擴(kuò)增，且條帶明顯。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，引物對(duì)IV是一對(duì)多物種檢測(cè)引物，可以特異性的擴(kuò)增牛、羊、豬DNA，結(jié)果證明對(duì)牛、羊、豬均有特異性擴(kuò)增，豬的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為605bp，牛的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為662bp，羊的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為915bp，但對(duì)鼠、兔DNA有明顯的非特異擴(kuò)增（如圖2所示）。引物對(duì)V對(duì)豬DNA有特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為387bp，對(duì)牛、羊DNA也有非特異擴(kuò)增，但同等條件下電泳顯示的條帶亮度比豬的產(chǎn)物明顯要弱。引物對(duì)VI可特異性擴(kuò)增豬DNA，產(chǎn)物大小為420bp，但對(duì)兔有很弱的非特異性擴(kuò)增。引物對(duì)VII是針對(duì)16S rRNA基因設(shè)計(jì)的引物，可以擴(kuò)增多個(gè)物種的基因組，本實(shí)驗(yàn)中該引物可特異性擴(kuò)增所有基因組DNA，其中豬的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為239bp，牛、羊的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為234bp，雞的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為249bp，與預(yù)期結(jié)果一致（如圖3所示）。

[M 1 2 3 4 5 6 7]

圖1 引物對(duì)II PCR產(chǎn)物檢測(cè)

注：M為GM334 DNA marker；1-7依次為：牛、羊、豬（712bp）、雞、鴨、鼠、兔。

[M 1 2 3 4 5 6 7]

圖2 引物對(duì)IV PCR產(chǎn)物檢測(cè)

注：M-GM334 DNA maker；1-7依次為：豬（605bp）、牛（662bp）、羊（915bp）、鼠、兔、雞、鴨。

圖3 引物對(duì)VII PCR產(chǎn)物檢測(cè)

注：M-GM334 DNA maker；泳道1-10：豬、牛、水牛、羊、雞、鴨、牛蛙、魚、鼠、兔。

2.3 條件優(yōu)化后的特異性檢測(cè)結(jié)果 對(duì)具有非特異性擴(kuò)增的引物體系進(jìn)行PCR優(yōu)化。優(yōu)化后引物對(duì)I能擴(kuò)增豬DNA而對(duì)本測(cè)試中其他物種無擴(kuò)增。引物對(duì)III優(yōu)化后在退火溫度達(dá)到66.5℃時(shí)對(duì)豬DNA仍有很好的特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100bp，但仍無法消除對(duì)牛DNA的非特異性擴(kuò)增。引物對(duì)IV優(yōu)化后特異性擴(kuò)增牛、羊、豬DNA，但值得注意的是，該引物在提高鎂離子濃度和退火溫度后，兔的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶亮度顯著降低，仍無法完全消除對(duì)兔和鼠DNA的非特異性擴(kuò)增，需降低電泳分辨率才能消除這種非特異性擴(kuò)增的影響。引物對(duì)V在優(yōu)化后仍無法消除對(duì)牛羊DNA的非特異性擴(kuò)增，而引物對(duì)VI優(yōu)化后對(duì)豬之外的測(cè)試物種無非特異性擴(kuò)增。引物對(duì)VII是一個(gè)多物種擴(kuò)增的引物，對(duì)測(cè)試物種能在寬泛的PCR條件下擴(kuò)增動(dòng)物的16S rRNA基因，是一個(gè)很好的可供用于動(dòng)物基因組檢測(cè)的參照基因。

2.4 不同酶對(duì)特異性的影響 Taq酶是PCR反應(yīng)的重要成分，對(duì)PCR的特異性和擴(kuò)增量有著直接影響，不同的酶在活性、保真性和性價(jià)比方面差異較大[7]。本實(shí)驗(yàn)中在用TaKaRa公司的EX Taq酶對(duì)上述7對(duì)引物擴(kuò)增后，更換Taq酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果表明，針對(duì)引物對(duì)I在其他條件不變的情況下，r Taq酶具有相對(duì)較高的特異性和經(jīng)濟(jì)性，相比EX Taq酶減少了牛的非特異擴(kuò)增。引物對(duì)VI在其他條件不變的情況下，使用r Taq酶和Thermofisher公司的DNA Taq酶時(shí)引物的特異性無顯著變化，但是目的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳亮度顯著提高，當(dāng)PCR程序降低至26個(gè)循環(huán)時(shí)非特異性擴(kuò)增在電泳中不可見。在其他5對(duì)引物PCR反應(yīng)體系中，r Taq酶和Thermofisher公司的DNA Taq酶以及高保真Taq酶都能特異性擴(kuò)增目的物種的DNA，且不同Taq酶之間的擴(kuò)增效果無明顯差別。

3 討論

近幾年，肉類食品摻假問題層出不窮，備受社會(huì)關(guān)注，不法商販為謀求利益，將相對(duì)便宜的豬肉、雞鴨肉甚至狐貍?cè)獾冗M(jìn)行處理，冒充價(jià)格較貴的牛羊肉或做成休閑食品。肉類摻假問題不僅影響經(jīng)濟(jì)、食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食品安全等，還帶來一系列社會(huì)問題，影響社會(huì)誠(chéng)信，并且可能帶來一些宗教信仰問題。另外，動(dòng)物飼料中添加明令禁止的牛羊源成分現(xiàn)象屢有發(fā)生，也給動(dòng)物養(yǎng)殖行業(yè)帶來了潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，動(dòng)物源性成分溯源鑒定是當(dāng)今社會(huì)監(jiān)督監(jiān)管和嚴(yán)格執(zhí)法的需要。

物種鑒定或飼料中動(dòng)物源性成分的鑒定經(jīng)歷了感官檢驗(yàn)和形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)的過程，隨后發(fā)展了蛋白質(zhì)分析方法，如ELISA法、免疫法、等電聚焦等方法。但在肉類加工的過程中，由于腌制、蒸煮、混合或者加入各種調(diào)料會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性遭到破壞，物種特有的蛋白質(zhì)或抗原決定部位也會(huì)遭到破壞，因此對(duì)于深加工后的肉類蛋白分析法存在不足，如ELISA法難以對(duì)混合肉的物種進(jìn)行鑒別[18]。核酸分析是伴隨著蛋白成分檢測(cè)發(fā)展起來的物種鑒定技術(shù)，主要是PCR及衍生技術(shù)，由于PCR反應(yīng)時(shí)間較短、操作簡(jiǎn)單、成本低，并且有較高的靈敏度和特異性，成為了物種鑒定中最常用的的技術(shù)[19]。PCR技術(shù)目前已經(jīng)發(fā)展了多種技術(shù)，在物種鑒定研究中得到廣泛應(yīng)用，目前多個(gè)物種如豬[2，5]、牛羊[2，4]等都采用了PCR鑒定技術(shù)。PCR技術(shù)的特異性和靈敏度除了引物外還受到反應(yīng)體系內(nèi)所有試劑的影響，包括DNA模板濃度和質(zhì)量、DNA聚合酶、MgCL2濃度等。DNA模板的質(zhì)量是影響PCR的重要因素，模板DNA中目的基因的原始拷貝數(shù)對(duì)PCR結(jié)果有著重要的影響，濃度較高、結(jié)構(gòu)完整且雜質(zhì)少的DNA模板可提高PCR效率。模板DNA提取過程中有機(jī)溶劑的殘留會(huì)影響DNA聚合酶的活性而影響擴(kuò)增效率。在物種檢測(cè)和溯源研究中有時(shí)候由于獲得微量樣品，DNA提取存在不可重復(fù)性，因此往往需要對(duì)PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最大化擴(kuò)增DNA模板的效果。本研究中使用了動(dòng)物組織作為DNA提取的材料，盡管樣品來源和處理不同，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看提取的DNA質(zhì)量足以滿足本研究的需要。另一方面，由于本研究中PCR均以mtDNA為靶標(biāo)，由于mtDNA的穩(wěn)定性好，本研究中所有提取的DNA均能滿足PCR擴(kuò)增的需求。同時(shí)合適的MgCL2濃度是保證Taq酶活性的基本條件，其濃度的優(yōu)化可以提高PCR體系的特異性。Taq酶對(duì)PCR體系特異性的影響較為顯著，Taq酶種類和特點(diǎn)以及自身的5′→3′聚合酶活性和外切酶活性以及3′→5′外切酶活性對(duì)于PCR的特異性都存在影響[7-8]。本研究中的EX Taq酶具有3′→5′外切酶活性，可對(duì)dNTP的錯(cuò)配進(jìn)行校正，保真性好，但是擴(kuò)增效率并不高。與此同時(shí)，EX Taq酶的擴(kuò)增條件更為嚴(yán)格，溫度范圍和鎂等離子濃度范圍更窄，PCR特異性與嚴(yán)格的條件優(yōu)化有關(guān)，否則難免有非特異性擴(kuò)增。rTaq酶沒有3′→5′外切酶活性，保真性相對(duì)較低，但它的擴(kuò)增條件較為寬泛，在本實(shí)驗(yàn)測(cè)試中相對(duì)特異性較好。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過對(duì)比7對(duì)豬源性成分鑒定相關(guān)的PCR引物，測(cè)試結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)條件中溫度、鎂離子濃度和不同批次及廠家的Taq酶對(duì)PCR的特異性均有影響，其中溫度、鎂離子濃度2個(gè)條件可以通過PCR優(yōu)化降低影響，提高特異性。而不同酶的測(cè)試表明，不同的酶有不同的活性，對(duì)PCR特異性造成一定影響，因此，要根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小以及實(shí)驗(yàn)需求來選擇合適的Taq酶。

綜上研究表明，在物種PCR鑒定中應(yīng)注意鎂離子濃度、退火溫度和不同Taq酶的選用，通過優(yōu)化鎂離子濃度、退火溫度和選擇合適的Taq酶可以有效提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)本研究也為將來建立多重PCR檢測(cè)多物種的方法提供了基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：張宏民）