楚振宇，周小林，薛振偉，崔梅萍，藺蘇琴，李瑞華

0 引 言

小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)惡性程度在所有肺癌類型中最高［1］，然而其對放化療敏感，如早期發(fā)現(xiàn)，采用綜合治療后5年生存率可達30%以上，因此SCLC的早期診斷和治療尤為重要。胃泌素釋放肽前體(pro-gastrin releasing peptide，PGRP)作為神經(jīng)內分泌性細胞來源的腫瘤如小細胞肺癌腫瘤標志物已得到廣泛認可［2－4］，其敏感性和特異性均高于血清神經(jīng)元特異烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)［5］，特別是對于局限期 SCLC的診斷具明顯優(yōu)勢［6－7］。在病情監(jiān)測、療效評估、預后等方面亦有較高準確性［8－9］，在臨床上有廣泛的應用前景［10－11］。本研究通過人工合成 PGRP抗原決定簇對本實驗室自行研制的單克隆抗體進行篩選;采用改良過碘酸鈉法對抗體進行辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記，從而建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)，并將此方法應用于癌癥患者PGRP濃度的檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PGRP抗原(本實驗室自行研制);抗原決定簇PGRP(31－98)序列中N端到C端的3個抗原肽段—GSLKQQLREYIR(肽段1)、NLLGLIEAK(肽段2)和KENRNHQPPQ PKALG(肽段3)，委托賽百盛公司合成;單克隆抗體19株(本實驗室采用雜交瘤技術自行研制的鼠單克隆抗體);多克隆抗體(本實驗室自行研制的兔多克隆抗體);辣根酶標記羊抗小鼠IgG(H+L)與辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(ZSGB-BIO公司生產(chǎn));HRP為AMRESCO公司生產(chǎn);癌癥患者血樣共67份(由太原腫瘤醫(yī)院提供)，血樣以離心半徑6 cm、3000r/min離心15min后收集上層血清;BioTek酶標儀(型號ELx800);Thermo Scientific微量分光光度計(型號NANODROP 2000);ELISA試劑盒(PGRP檢測試劑盒為IBL公司生產(chǎn));本實驗所選用化學試劑規(guī)格皆為分析純。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA法篩選單克隆抗體 以3條肽段與全肽段PGRP(31－98)作為抗原，分別溶于0.05 mol/L pH 9.6碳酸鹽包被液中，包被聚苯乙烯板孔，包被濃度為 150 ng/100 μL，每孔包被 100 μL，4 ℃冰箱培育24 h;用含有0.05%吐溫－20的等滲鹽水的洗液洗板4次后對包被后的板條進行封閉，封閉液使用含有1%BSA的PBS溶液(0.01 mol/L pH7.4)150 μL，4℃冰箱培育24 h;移除封閉液后自然晾干板條;在封閉后的板孔中分別加19種不同細胞株的單克隆抗體，2 孔/株，50 μL/孔，37 ℃恒溫箱培育 45 min;移除單克隆抗體，洗液洗板4次后，加HRP標記羊抗鼠抗體50μL/孔，37℃恒溫箱培育30min;移除二抗并重復洗板4次，每孔各添加底物A、B液50 μL，37℃恒溫箱培育15 min;4 mol/L濃硫酸終止反應后顯色，酶標儀讀取450 nm波長處吸光度值(A值)，記錄讀數(shù);重復4次，計算算術平均值。

1.2.2 單克隆抗體HRP標記 采用改良過碘酸鈉法標記HRP(1mg)至所需單克隆抗體(2mg)，低pH條件下NaIO4氧化HRP表面糖分子成醛基，與Ig的氨基相結合形成斯夫氏堿，后利用NaBH4還原結合物形成穩(wěn)定的酶標抗體。使用微量分光光度計分別檢測標記后單克隆抗體A403、A280，重復檢測3次，記錄結果并計算標記后HRP量、IgG量及標記率，單位為mg/mL。公式如下:

HRP 酶量 =A403×0.4

IgG 量 =(A280－A403×0.3)×0.62

1.2.3 雙抗體夾心ELISA檢測PGRP 包被抗體:選用E12株單克隆抗體包被聚苯乙烯板條，包被及封閉條件同ELISA篩選單克隆抗體實驗;抗原:選用本實驗室自行研制PGRP抗原，配制成不同梯度濃度，抗原稀釋液使用 0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液。酶標抗體選用兔抗鼠多克隆抗體作為一抗，HRP酶標記的羊抗兔多克隆抗體作為二抗，HRP標記DD2、ED1鼠源單克隆抗體。利用方陣滴定法得到包被抗體與標記抗體的配比濃度A值，繪制工作濃度曲線，取斜率最大并且讀數(shù)接近1.0處的抗體濃度作為各株抗體最適工作濃度。實驗步驟:首先在包被E12株單克隆抗體的板條中加不同濃度的PGRP抗原，使得每列板孔中抗原濃度相同并呈梯度降低，抗原抗體穩(wěn)定結合后使用酶標記抗體檢測并顯色、記錄讀數(shù)，具體實驗條件控制同間接法篩選單克隆抗體實驗。實驗重復4次，計算算術平均值。

1.2.4 血清檢測 以E12為包被單克隆抗體、ED1作為標記抗體，以本實驗室自制抗原作為標準抗原，同時對67份癌癥患者血清進行檢測。

2 結 果

2.1 單克隆抗體篩選結果 E12單克隆抗體只與肽段3結合，明顯高于全序列肽段;FB4單克隆抗體與3條肽段都可以結合，但與肽段2的結合力高于其他肽段;ED1單克隆抗體只與肽段2結合，但結合力明顯低于全序列肽段。

2*B3、ED2、EC6 3株單克隆抗體分別與3條肽段均可結合，結合力相近;DD2及其他12株單克隆抗體僅與全肽段結合，而不與所選的3條肽段結合。見表1。

2.2 夾心ELISA檢測結果 E12單克隆抗體包被與3種不同酶標抗體檢測PGRP抗原濃度曲線中ED1斜率最高，結合效果最好，兔多克隆抗體斜率最低。見表2，圖1。

表1 人工合成3條肽段與全序列肽段篩選單克隆抗體ELISA實驗結果Table 1 ELISA experiment results of screening monoclonal antibodies with three peptides and complete sequence peptide

表2 E12單克隆抗體與不同酶標抗體夾心檢測PGRP抗原濃度結果Table 2 Results of PGRP antibody density by sandwich detection of E12 mAb and different enzyme-labeled antibodies

圖1 E12單克隆抗體包被與不同酶標抗體夾心檢測抗原濃度曲線圖Figure 1 Curve chart of PGRP antibody density by sandwich detection of d E12 mAb coating and different enzyme-labeled antibodies

2.3 癌癥患者血清檢測結果 本方法的檢測范圍為33～1.7×104pg/mL;IBL公司試劑盒檢測檢測范圍為16～800 pg/mL。在靈敏度方面，抗原濃度在33～200 pg/mL范圍內時，IBL試劑盒檢測標準曲線斜率最高，而本方法的檢測標準曲線趨于平滑，曲線斜率近似一致，并未明顯增高或降低?？乖瓭舛仍?0～800 pg/mL范圍內時，IBL試劑盒檢測A值均高于本方法，此范圍內標準曲線斜率高于本方法。見圖2。利用E12單克隆抗體包被，酶標ED1單克隆抗體建立的雙單克隆抗體夾心ELISA檢測癌癥患者血清PGRP濃度，界定濃度值設為46pg/mL，陽性有4例，陰性值63例;使用市售PGRP試劑盒對同一批次癌癥患者血清檢測，其中陽性8例，陰性59例。本方法和IBL試劑盒檢測靈敏度均為100%，特異度分別為98.4%和92.2%。

圖2 不同方法檢測癌癥患者血清標準抗原濃度曲線Figure 2 Curve chart of standard antibody density in patients'serum by different detection methods

3 討 論

PGRP抗原在人體內有3種同型異構體，其抗原表面有多個抗原決定簇，每個抗原決定簇由幾個到十幾個氨基酸或碳水基團組成，每一株單克隆抗體僅結合其中一個抗原決定簇。由于抗原決定簇的性質大部分由蛋白質一級結構決定，因此人工合成抗原共有序列肽段的部分氨基酸序列可得到PGRP抗原決定簇，借此篩選出結合不同位點的單克隆抗體，應用此方法建立單克隆抗體夾心ELISA實驗。

我們實驗結果表明FB4株單克隆抗體與肽段1和肽段3均可以結合，說明其不是真正意義的單克隆抗體，考慮下一步工作復蘇細胞進行克隆化處理;E12株單克隆抗體僅與肽段3結合，ED1株單克隆抗體僅與肽段2結合，確立這2株單克隆抗體作為一組體系并進行ELISA方法的建立;DD2及其他12株單克隆抗體與合成的3條肽段都不存在結合位點，說明其結合的抗原位點在全肽段其他序列中，所以選取DD2株單克隆抗體搭配E12作為另一組體系進行研究;以E12株單克隆抗體作為包被抗體，分別與DD2、ED1株辣根酶標記的單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA檢測PGRP抗原。為了與雙單克隆抗體體系比較，利用兔多克隆抗體作為一抗、酶標羊抗兔IgG作為二抗搭配E12株單克隆抗體，建立單克隆抗體、多克隆抗體雙抗體夾心ELISA共同檢測抗原。

在利用3種夾心抗體檢測自制PGRP標準抗原實驗中，3條標準濃度曲線線性關系良好;在半對數(shù)曲線斜率方面，E12株單克隆抗體曲線斜率最高，多克隆抗體組斜率最低;多克隆抗體組陰性對照值較高，考慮是因為多克隆抗體相對分子質量大、空間結構更為復雜、與抗原結合的基團較多等因素有關;利用方陣法確定的抗體工作濃度，ED1株單克隆抗體效價最高。

本方法的檢出限要高于商品化試劑盒，雖然對陽性檢出結果無明顯影響，但是在低濃度水平范圍的檢測還不能達到理想水平;另外，從2種方法的標準抗原濃度曲線可以看出，在抗原濃度在低濃度水平范圍內時(＜100 pg/mL)，試劑盒的曲線斜率要高于本方法的斜率，也就是說，在此范圍內本方法對于單位抗原濃度變化較試劑盒來說不夠靈敏。

我們的實驗避免2種單克隆抗體交叉同一抗原決定簇而產(chǎn)生競爭性抑制，對作為一抗的單克隆抗體利用改良過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記，建立雙抗體夾心ELISA，并應用于患者血清樣品的檢測。此方法優(yōu)點如下:2種單克隆抗體特異結合同一抗原的不同位點可避免假陰性結果出現(xiàn);避免了2種單克隆抗體競爭性結合同一抗原決定簇，所以酶標抗體的酶聯(lián)信號釋放程度非常;因為未使用二抗，相較于成型的PGRP抗原檢測ELISA方法更為簡潔有效，并可減少非特異反應發(fā)生的概率。

［1］李 靜，武新虎，朱錫旭.非小細胞肺癌EGFR-TKI耐藥機制及耐藥后治療策略［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(8):859-863.

［2］Kudo K，Ohyanagi F，Horiike A，et al.Clinicopathological findings of non-small-cell lung Cancer with high serum progastrin-releasing peptide concentrations［J］.Lung Cancer，2011，74(3):401-404.

［3］Korse CM，Taal BG，Vincent A，et al.Choice of tumour markers in patients with neuroendocrine tumours is dependent on the histological grade.A marker study of Chromogranin A，Neuron specific enolase，Progastrin-releasing peptide and cytokeratin fragments［J］.Eur J Cancer，2012，48(5):662-671.

［4］Miyake Y，Kodama T，Yamaguchi K.Pro-gastrin-releasing peptide(31-98)is a specific tumor marker in patients with small cell lung carcinoma［J］.Cancer Res，1994，54(8):2136-2140.

［5］許德兵，宋 勇.分子生物標志物在肺癌早期診斷中的研究進展［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(7):766-770.

［6］Nisman B，Biran H，Ramu N，et al.The diagnostic and prognostic value of ProGRP in lung Cancer［J］.Anticancer Res，2009，29(11):4827-4832.

［7］Stieber P.Pro-gastrin-releasing peptide(ProGRP)-A diagnostic biomarker for small-cell lung cancer［J］.Chin J Lung Cancer，2009，12(3):183-186.

［8］Niho S，Nishiwaki Y，Goto K，et al.Significance of serum progastrin-releasing peptide as a predictor of relapse of small cell lung Cancer:comparative evaluation with neuron-specific enolase and carcinoembryonic antigen［J］.Lung Cancer，2000，27(3):159-167.

［9］Shibayama T，Ueoka H，Nishii K，et al.Complementary roles of pro-gastrin-releasing peptide(ProGRP)and neuron specific enolase(NSE)in diagnosis and prognosis of small-cell lung Cancer(SCLC)［J］.Lung Cancer，2001，32(1):61-69.

［10］周明非，張賀秋，凌世淦.小細胞肺癌腫瘤標志物——胃泌素釋放肽前體酶聯(lián)免疫檢測方法的研究進展［J］.軍事醫(yī)學科學院院刊，2000，24(2):143-146.

［11］王敏杰，李學祥，高 佳，等.血清PGRP、TPS及NSE在小細胞肺癌患者治療監(jiān)測中的應用［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2011，34(2):152-157.

［12］Torsetnes SB，Nordlund MS，Paus E，et al.Digging deeper into the field of the small cell lung Cancer tumor marker ProGRP:a method for differentiation of its isoforms［J］.Proteome Res，2013，12(1):412-420.