伍尚敏，洪曉婭，伍　可，蘇曉三，余　璐，高　揚(yáng)

（1.昆明市第一人民醫(yī)院暨昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院·昆明學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科云南昆明650011；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科遼寧大連116000）

VEGF-殼聚糖微囊復(fù)合緩釋載體的制備

伍尚敏1，洪曉婭1，伍可2，蘇曉三1，余璐1，高揚(yáng)1

（1.昆明市第一人民醫(yī)院暨昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院·昆明學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科云南昆明650011；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科遼寧大連116000）

目的：研究VEGF（vascular endothelial growth factor）-殼聚糖緩釋微囊的制備工藝。方法：采用離子沉淀-凝聚法制備VEGF-殼聚糖緩釋微囊，并檢測其包封率和載藥量。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)制備的VEGF-殼聚糖緩釋微囊包封率為87%，載藥量為4.35%，微囊大小均勻，光潔度與成形度好。結(jié)論：本制備工藝方法簡單易行，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。說明利用天然高分子多糖類物質(zhì)殼聚糖來包封VEGF是切實(shí)可行的，VEGF-殼聚糖緩釋微囊具有進(jìn)一步研究和應(yīng)用價值。

血管內(nèi)皮生長因子；殼聚糖；微囊；載藥量；包封率

在組織移植和創(chuàng)傷修復(fù)的過程中局部微循環(huán)的建立和充足的血供對提高移植組織的存活率、促進(jìn)創(chuàng)傷的快速愈合具有重要作用。傳統(tǒng)方法多采用直接添加外源性生長因子的手段，此種添加方式易造成其濃度僅一過性增高而難以形成長期穩(wěn)定的有效濃度。研究表明，血管內(nèi)皮生長因子是血管生成的重要因子，它促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，血管增生，延長血管內(nèi)皮細(xì)胞的壽命以及增加血管通透性和血管維持作用［1-2］。外源性單純局部供給VEGF往往利用率較低或較快代謝，影響了移植物的存活，因而研制一種能提高VEGF生物利用度的長效緩釋制劑就顯得尤為重要。

殼聚糖是一種無毒，無免疫抗原反應(yīng)，可生物降解的天然高分子聚陽離子聚合物，具有pH響應(yīng)性和良好的生物相容性及成膜性、且易于進(jìn)行修飾［3-4］，可作為優(yōu)良的藥物控緩釋及靶向載體，黏膜吸附劑、吸收促進(jìn)劑等，是一種新型生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞應(yīng)用材料［5］。

近年來，殼聚糖作為控釋輔料在藥物傳遞系統(tǒng)中得到了廣泛的應(yīng)用，曾見報道納米微囊-VEGF復(fù)合體對創(chuàng)傷、慢性創(chuàng)面等的愈合影響研究［6-9］，但較少論及VEGF-殼聚糖緩釋微囊具體制備方法及結(jié)果測試。本實(shí)驗(yàn)制備VEGF殼聚糖緩釋微囊并檢測其包封率、載藥量和體外釋放特征，旨在為VEGF-殼聚糖微囊復(fù)合緩釋載體在相關(guān)研究中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

殼聚糖（sigma 448869）、吐溫-80（Solarbio T8360）、硫酸鈉（西隴化工股份有限公司）、冰醋酸（光東光華科技股份有限公司）、重組大鼠VEGF溶液（PEPROTECH 400-31）、大鼠VEGF ELISA試劑盒（欣博盛ERC103）、PBS（Hyclone SH30256）；使用儀器有：移液槍、磁力攪拌器、超聲波發(fā)生器、顯微鏡、離心機(jī)、電子天平、凍干機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測儀，恒溫孵育箱、紫外分光光度計(jì)。

1.2方法

1.2.1制備空白殼聚糖微囊球：制作空白殼聚糖，用作VEGF載體。

1.2.1.1微囊球溶解液：①2%冰醋酸溶液（2ml冰醋酸加雙蒸水至100ml，pH值6.2）；②20%硫酸鈉溶液（20克硫酸鈉溶解到雙蒸水中，定容至100ml）。

1.2.1.2稱取0.25g殼聚糖，用100ml 2%冰醋酸溶液溶解、磁力攪拌器攪拌20min。加入1ml吐溫-80，磁力攪拌20min，滴加20%的硫酸鈉溶液至溶液渾濁。

1.2.1.3取少量溶液通過紫外分光光度計(jì)于500nm處檢測其濁度來判定微球的形成。微球形成后繼續(xù)磁力攪拌30min，超聲波處理10min，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，1 200rpm離心15min，上清液倒掉。重復(fù)“加入5ml雙蒸水重懸，1 200rpm離心15min，上清液倒掉”3次。冷凍干燥，4℃保存。

1.2.2制備VEGF殼聚糖微囊

1.2.2.1溶液：①空白殼聚糖微囊溶解液；②2%冰醋酸溶液（2ml冰醋酸加雙蒸水至100ml，pH值6.2）；③重組大鼠VEGF溶液（30μg VEGF溶于500μl雙蒸水中）。

1.2.2.2制備VEGF殼聚糖微囊：取1mg冷凍干燥的空白殼聚糖微球，用2ml醋酸緩沖液溶解，加入500μl（500μg）VEGF溶液。4℃條件下磁力攪拌60min，轉(zhuǎn)入到15ml離心管。4℃，10 000～12 000rpm離心10min，收集上清液，為離心液。沉淀中加入1ml雙蒸水，重懸。4℃，10 000～12 000rpm離心10min，收集上清液，為洗滌液。沉淀中加入1ml雙蒸水，重懸。收集上清液，為洗滌液。沉淀中加入1ml雙蒸水，重懸。將收集的上清液（離心液和洗滌液）收集合并為“合并液”共3.5ml，放入4℃冰箱備用。沉淀物凍干保存與-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3VEGF殼聚糖微囊載藥量及其包封率的測定

1.2.3.1樣品準(zhǔn)備：將制備VEGF殼聚糖微囊時所收集的合并液用ELISA試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品跟樣品通用稀釋液稀釋1 000倍。

1.2.3.2檢測前準(zhǔn)備工作：提前20min從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫；用雙蒸水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液；標(biāo)準(zhǔn)品：加入標(biāo)準(zhǔn)品跟樣品通用稀釋液0.5ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜止15min，待其充分溶解后，輕輕混勻（濃度為1 000pg/ml）。然后再進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后標(biāo)準(zhǔn)曲線使用濃度為1 000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ ml、15.60pg/ml；生物素化抗體工作液：使用前20min，用生物素化抗體稀釋液將30×的濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作液；酶結(jié)合物工作液：使用前20min，用酶結(jié)合物稀釋液將30×的濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作液。

1.2.3.3測定吸光度：從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條，空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品（100μl/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90min。提前20min準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μl，靜止30s后甩盡液體，在干凈的吸水紙上排干，洗板5次?？瞻卓准由锼鼗贵w稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液（100μl/孔）。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育60min。提前20min準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫（22～25℃）放置。洗板5次?？瞻卓准用附Y(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液（100μl/孔）。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱，避光孵育30min。打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。洗板5次。加入顯色底物（TMB）100 μl/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15min。加入終止液100μl/孔，混勻后即刻測量OD450值（3min內(nèi)）。

1.2.4計(jì)算包封率（%）和載藥量（%）：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所測的OD值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式。包封率（%）=（投藥量-合并液中藥量）/投藥量×100%，載藥量（%）=（投藥量-合并液中藥量）/微囊重量×100% 1.2.5 VEGF殼聚糖微囊囊體外釋放實(shí)驗(yàn)：取0.05mg VEGF-殼聚糖微囊，混懸于1ml PBS中，濃度為50μg/ml。37℃恒溫下磁力攪拌30min。將攪拌好的VEGF-殼聚糖微囊用PBS進(jìn)行梯度稀釋，稀釋梯度為10，102，103，104，105，稀釋后VEGF-殼聚糖微囊的濃度分別為5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml、0.0005μg/ml。分別將5個梯度的VEGF-殼聚糖微囊溶液于24h、48h、72h、96h、120h時收集樣品，每個樣本收集500μl溶液。將收集的樣品以10 000r/min離心15min，取上清液10μl，凍存于-20℃冰箱中。待120h后樣品全部收集完成，ELISA檢測其450nm處的OD值，根據(jù)所測樣品OD值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式（表3）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。

2　結(jié)果

2.1微囊500nm處的OD值

空白管OD值0.035，殼聚糖管OD值1.975，OD500nm=1.975-0.035=1.940。

2.2微囊外觀

在光學(xué)顯微鏡100倍下觀察制的空白殼聚糖微囊（圖1）和VEGF殼聚糖微囊（圖2）。

2.3VEGF殼聚糖微囊包封率（%）和載藥量（%）

不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品（100μl/孔）OD450值見表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：Y=0.00104X+ 0.0842，R2=0.999，VEGF殼聚糖微囊樣品在450nm處的OD值為1.292、1.290、1.291，平均值為1.291，即

圖1　A超聲波處理之前空白殼聚糖微囊顯微鏡照片（×200）

圖1　B超聲波處理之后空白殼聚糖微囊顯微鏡照片（×200）

表1　450nm處所測OD值的數(shù)據(jù)

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線公式

公式中的Y=1.291，將1.291帶入公式中得出X= 1114（pg/ml），樣品稀釋倍數(shù)為1 000倍，合并液總體積為3.5ml，則3.5ml合并液中的VEGF量為：1.114X10-3×103×3.5=3.9μg，包封率=（30-3.9）/ 30×100%=87%，載藥量=（30-3.9）/600×100%= 4.35%。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

2.5VEGF殼聚糖微囊體外釋放趨勢

ELISA檢測450nm處的OD值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式（表2）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，即可得出VEGF-殼聚糖微囊在PBS溶液中同一濃度不同時間藥物釋放趨勢（圖5）和同一時間不同濃度藥物釋放趨勢曲線（圖6）。

3　討論

殼聚糖微囊包封藥物有以下特點(diǎn)：①有明顯的控制藥物釋放和延長藥效的作用；②增加藥物的靶向性；③降低所包封藥物的毒副作用；④提高藥物的穩(wěn)定性；⑤提高疏水性藥物對細(xì)胞膜的通透性。

圖2　VEGF殼聚糖微囊顯微鏡照片（×200）

圖3　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所測的OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　VEGF殼聚糖微囊在PBS溶液中釋放的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5　同一濃度不同時間藥物釋放趨勢

圖6　同一時間不同濃度藥物釋放趨勢

本實(shí)驗(yàn)采用離子沉淀-凝聚法制備VEGF-殼聚糖緩釋微囊，微囊在500nm處的OD值：空白管OD值0.035，殼聚糖管OD值1.975，OD500nm=1.975-0.035=1.940，即實(shí)驗(yàn)組（殼聚糖組）跟空白組（冰醋酸溶液跟硫酸鈉溶液）相比，OD值明顯升高，可見實(shí)驗(yàn)組已經(jīng)形成了大量的殼聚糖微囊。在圖1中，從A圖和跟B圖看出，超聲波處理之后殼聚糖微囊大大降低了粘附程度，這樣更有利于VEGF進(jìn)入殼聚糖中。

載藥量可直接影響臨床用藥劑量，而包封率則體現(xiàn)了制備工藝的優(yōu)劣及制劑質(zhì)量［10］。本實(shí)驗(yàn)所得的VEGF殼聚糖緩釋微囊包封率尚好，為87%，表明本實(shí)驗(yàn)VEGF-殼聚糖緩釋微囊制備工藝較好，原料利用率高，微球的球型度和光潔度也比較好。但載藥量較低，為4.35%，預(yù)計(jì)可通過增加VEGF濃度加以提升，或者進(jìn)一步尋求更利于提高載藥量的方法。

從圖5中可以看出：當(dāng)VEGF殼聚糖微球的濃度相同時，隨著時間的推移，VEGF是持續(xù)地從殼聚糖中釋放出來，當(dāng)釋放到一定量時VEGF將不再釋放，其中12～48hOD值變化較小，即VEGF的濃度變化較小，VEGF殼聚糖微球中的VEGF釋放較慢，48～72hOD值變化較大，VEGF的濃度變化較大，及VEGF殼聚糖微球中的VEGF釋放較快，72～96hOD值變化又趨于平緩，VEGF殼聚糖微球中的VEGF緩慢釋放。96h之后OD值幾乎不再變化，即VEGF幾乎不再釋放。

圖6顯示：5個不同的濃度在24h之內(nèi)OD值幾乎不變化，即VEGF的濃度幾乎沒有變化，VEGF殼聚糖微球中的VEGF幾乎不釋放，48h之后VEGF殼聚糖微球濃度越高，所測OD值越大，即PBS溶液中VEGF濃度越高，即48h之后VEGF殼聚糖微球濃度越高，VEGF殼聚糖微球中的VEGF釋放越多。但當(dāng)VEGF殼聚糖微球濃度稀釋到1 000倍時，OD值變化緩慢，即VEGF釋放緩慢。

殼聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作為優(yōu)良的藥物控緩釋及靶向載體，黏膜吸附劑、吸收促進(jìn)劑，因此利用天然高分子多糖類物質(zhì)殼聚糖包封VEGF是切實(shí)可行的。由于VEGF在血管生成過程中具有重要而廣泛的活性，VEGF-殼聚糖緩釋微囊作為新劑緩釋載體，對細(xì)胞和組織等無毒性，能以適當(dāng)速度被吸收降解，對VEGF有較高的包封率及穩(wěn)定的緩釋效果，因而具有很好的科研和臨床應(yīng)用前景。

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編輯/張惠娟

Preparation of VEGF-chitosan microcapsules

WU Shang-min1，HONG Xiao-ya1，WU Ke2，SU Xiao-san1，YU Lu1，GAO Yang1
（1.Department of Plastic Surgery，The First People's Hospital of Kunming，The Affiliated Calmette Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650011，Yunnan，China；2.Department of Oncology，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116000，Liaoning，China）

ObjectiveTo investigate the preparation of VEGF-chitosan microcapsules.Methods VEGF-chitosan microcapsules were prepared by using of ion precipitation-coacervation method，and the drug loading and encapsulation efficiency were investigated.Results The microcapsules were in uniformsize，goodfinishandshape，entrapmentefficiencyof87%，drugloadingof4.35%. Conclusions The coagulation method is simple，stable and good reproducible.The results show that it is practicable to encapsulate VEGF by using of natural polymer polysaccharide chitosan.The VEGF-chitosan microcapsules have futher development and application value.

VEGF（vascularendothelialgrowthfactor）；chitosan；microcapsules；drugloading；encapsulated efficency

Q813.1

A

1008-6455（2015）22-0029-04

2015-08-15

2015-10-30