王作龍，鐘乃風(fēng)，馬 莉＊＊

(1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550004;2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生物與工程學(xué)院生物技術(shù)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種與HLA-B27有明顯相關(guān)性的全身性自身免疫性疾病，一般以骶髂關(guān)節(jié)為首發(fā)部位，逐漸累及人類(lèi)各種軟骨組織、脊柱及四肢關(guān)節(jié)[1]。AS發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，近年來(lái)有多種假說(shuō)被提出，諸如遺傳假說(shuō)、免疫假說(shuō)、細(xì)菌感染假說(shuō)、DNA甲基化，未折疊蛋白反應(yīng)假說(shuō)等[2-3]。免疫系統(tǒng)的異常是自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的中心環(huán)節(jié)，已有文獻(xiàn)報(bào)道在AS疾病中，人類(lèi)T細(xì)胞亞群的失衡起關(guān)鍵作用[4]。依據(jù)CD4+T細(xì)胞分化和功能將其分為輔助性 T細(xì)胞 1(Th1)、輔助性 T細(xì)胞 2(Th2)，以及發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)等亞群。已有不少研究發(fā)現(xiàn)AS患者外周血Th1細(xì)胞明顯增高和Treg、Th2細(xì)胞減低，但同時(shí)對(duì)Th1、Th2及Treg細(xì)胞在AS患者外周血中的檢測(cè)，報(bào)道較少，在AS患者中是否存在Th1/Th2/Treg失衡，以及這種失衡對(duì)AS的相關(guān)性，本研究通過(guò)檢測(cè)AS患者外周血中Th1(CD3+CD8-INF-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)、Treg(CD4+CD127LOWCD125+)細(xì)胞[5]，分析 Th1、Th2、Treg細(xì)胞數(shù)量改變與AS發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，以期了解AS的免疫平衡狀態(tài)，為AS的臨床診斷及治療提供新思路新方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

78例AS患者，男65性例，女性13例，17～53歲，平均(26+7.8)歲，AS疾病的診斷，符合1984年紐約修訂標(biāo)準(zhǔn)，HLA-B27均為陽(yáng)性，均未經(jīng)任何治療[6]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他慢性病;(2)明顯血液學(xué)指標(biāo)異常;(3)其他自身免疫性疾病;(4)免疫抑制類(lèi)藥物治療史;(5)免疫相關(guān)性疾病;(6)肝、腎功能異常。采集標(biāo)本前，患者均自愿簽署知情同意書(shū)，填寫(xiě)病例調(diào)查表以及Bath AS功能指數(shù)(BASFI)、Bath AS病情活動(dòng)指數(shù)(BASDAI)表格。依據(jù)Bath AS病情活動(dòng)指數(shù)，將AS組分為低活動(dòng)性AS組(BASDI＜4分，44例)、高活動(dòng)性 AS組(BASDI≥4分，34例)，兩組間年齡及性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.815)。選取30名健康體檢者作為正常對(duì)照組，其中男16名、女14名，15～52歲，平均年齡(25±8)歲 ，無(wú)HIV感染及重大疾病史。AS組與正常對(duì)照組之間性別構(gòu)成及年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.773)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有AS患者及正常對(duì)照組受檢者均于上午8∶00～10∶00空腹抽取靜脈血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，2 h內(nèi)用于 Th1、Th2、Treg細(xì)胞檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞體外刺激活化 取上述經(jīng)EDTA-K2抗凝的靜脈血，用淋巴細(xì)胞液分離密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL接種于6孔培養(yǎng)板，加入PMA和Io，使終濃度分別為1和1.7 μg/mL。然后置于37℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，刺激培養(yǎng)4～6 h。以上試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.3 CD69的檢測(cè) 通過(guò)檢測(cè)CD3+CD8-T淋巴細(xì)胞膜表面的CD69表達(dá)，監(jiān)測(cè)激活效果。當(dāng)CD69表達(dá)＞90%(圖1)方可進(jìn)行Th1、Th2細(xì)胞的檢測(cè)。

1.2.4 Th1、Th2、細(xì)胞檢測(cè) 取兩支試管，一個(gè)標(biāo)記為同型對(duì)照管，另一個(gè)為測(cè)試管，分別加入CD3-FITC、CD8-PECy7 抗體各 20 μL，再加入 50 μL 已刺激培養(yǎng)后的全血，混勻，室溫避光孵育15 min;溶血，PBS洗滌2次，加入破膜劑1 mL，進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，分別加入對(duì)應(yīng)抗體標(biāo)記同型對(duì)照(-)及Th1/Th2(+)，混勻，室溫避光孵育15 min;PBS洗滌1次后，上機(jī)檢測(cè)。Th1、Th2、細(xì)胞的結(jié)果分別以 CD3+CD8-IFN-r+、CD3+CD8-IL-4+細(xì)胞的百分率表示。

1.2.5 Treg細(xì)胞檢測(cè) 取兩支試管，第一管做同型對(duì)照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗體20 μL，第二管加入 Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 uL，再分別加入 EDTA-K2抗凝外周血50 μL，混勻，室溫避光孵育15 min，其余步驟同 Th1，上機(jī)檢測(cè)。Treg細(xì)胞的結(jié)果以CD4+CD127LOWCD25+細(xì)胞的百分率表示。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Canto II。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

流式分析數(shù)據(jù)采用Diva分析軟件，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。以(±s)表示各組檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)。采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較;采用Pearson相關(guān)分析方法進(jìn)行相關(guān)性分析，當(dāng)|r|＞0.7 時(shí)為高度相關(guān)，當(dāng) 0.4≤|r|＜0.7 時(shí)為中度相關(guān)，當(dāng)|r|＜0.4時(shí)為低度相關(guān)。當(dāng) P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

高活動(dòng)性AS組和AS組外周血Th2細(xì)胞均低于低活動(dòng)性AS組和正常對(duì)照組(P均＜0.05，表1、圖3)，且高活動(dòng)性AS組明顯低于低活動(dòng)性AS組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而低活動(dòng)性AS組與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AS組外周血Treg細(xì)胞與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);AS低活動(dòng)性組外周血Treg細(xì)胞與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);AS高活動(dòng)性組外周血Treg細(xì)胞明顯低于正常對(duì)照組和AS低活動(dòng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)表1、圖4。

表1 AS組及正常對(duì)照組外周血Th1、Th2、Treg細(xì)胞量的比較(%)Tab.1 Comparison of quantity of Th1，Th2 and Treg cells between the AS group and normal control group in peripheral blood

2.1 外周血中Th1、Th2及Treg亞群

AS組外周血Th1細(xì)胞均明顯高于正常對(duì)照組(P 均 ＜0.01，表 1、圖 2)，高活動(dòng)性 AS 組明顯高于低活動(dòng)性AS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD8-CD69+細(xì)胞(CD69細(xì)胞)設(shè)門(mén)分析方法Fig.1 CD3+CD8-CD69+cells detected by flow cytometry

圖2 Th1細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)Fig.2 The percent of Th1 cells(%)

圖3 Th2細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)(%)Fig.3 The percent of Th2 cells(%)

圖4 Treg細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)(%)Fig.4 The percent of Treg cells(%)

2.2 外周血Th1、Th2、Treg細(xì)胞與AS活動(dòng)性的相關(guān)性

AS患者外周血Th1細(xì)胞比例與Bath強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)指數(shù)(BASDI)呈正相關(guān)，Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞與BASDI均呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 AS患者外周血Th1、Th2、Treg細(xì)胞與BASDI的相關(guān)性分析Tab.2 The analysis for correlation of Th1，Th2 and Treg cells in peripheral blood of AS patients with BASDI

3 討論

AS被認(rèn)為與遺傳、環(huán)境，感染相關(guān)一種嚴(yán)重的慢性炎性風(fēng)濕性疾病[7]。目前發(fā)現(xiàn)在AS這類(lèi)自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中，免疫功能紊亂起重要作用，如 B淋巴細(xì)胞亞群[8]、CD4+T淋巴細(xì)胞異常[9]。初始 CD4+T 細(xì)胞，在 IFN-γ、IL-2 等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，分化為T(mén)h1細(xì)胞，在IL-4等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下分化為T(mén)h2細(xì)胞，在TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下分化為T(mén)reg細(xì)胞[10]。

Th1 細(xì)胞分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-β 等細(xì)胞因子，主要參與介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化，以及遲發(fā)型超敏反應(yīng)，增強(qiáng)其抗感染能力，同時(shí)可抑制過(guò)度的Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，AS患者Th1細(xì)胞增高，符合與Nurieva等[11]對(duì)AS患者Th1、Th2細(xì)胞的研究結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)，患者外周血Th1細(xì)胞與BASDI(即AS活動(dòng)性)呈明顯正相關(guān)。低活動(dòng)性AS組(也就是AS早期)，就出現(xiàn)Th1細(xì)胞數(shù)量的異常增高，且伴隨AS活動(dòng)性的增高，Th1細(xì)胞異常增高的程度更為顯著。由此可見(jiàn)，AS是一類(lèi)由Th1細(xì)胞亞群驅(qū)動(dòng)的疾病，且與疾病活動(dòng)性高度相關(guān)。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-6等細(xì)胞因子，主要參與抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、B細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞活化以及 IgE的生成，Th2細(xì)胞分泌的IL-4是重要的抑制炎癥因子，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)Ig類(lèi)別的轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，AS患者Th2細(xì)胞與AS活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)，且在AS患者外周血中，表現(xiàn)為細(xì)胞百分含量的降低。低活動(dòng)性AS組外周血Th2細(xì)胞稍降低，但與對(duì)照正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);伴隨著AS患者病情的進(jìn)展，導(dǎo)致高活動(dòng)性AS組Th2細(xì)胞明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.01)。提示在AS早期，在AS患者自身免疫系統(tǒng)中，Th2細(xì)胞抑制炎癥作用并不不明顯，而AS晚期，Th1細(xì)胞的增高，可能導(dǎo)致了Th2細(xì)胞的大幅度降低，Th1和Th2產(chǎn)生的細(xì)胞因子間，存在交叉調(diào)節(jié)作用。由Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可抑制Th2細(xì)胞分化增殖。本研究在CD4+Th細(xì)胞亞群中，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AS患者中為主導(dǎo)，Th1細(xì)胞的明顯增多導(dǎo)致Th2細(xì)胞負(fù)調(diào)節(jié)作用減弱，產(chǎn)生了過(guò)多的炎性細(xì)胞因子，致使抗炎介質(zhì)的缺乏，Th1激活程度低下，Th2激活程度增強(qiáng)，最終導(dǎo)致Th1/Th2失衡。并且這種失衡是一種漸進(jìn)的趨勢(shì)。

Treg細(xì)胞根據(jù)來(lái)源分為天然 Treg細(xì)胞(nT-regs)和誘導(dǎo)性 Treg細(xì)胞(iTregs)，nTregs由胸腺細(xì)胞自然分化發(fā)育而來(lái)，iTregs由外周成熟的CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞受到特異性抗原刺激并在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化而來(lái)，具自身特異性，免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能[12]，外周的 iTregs 通過(guò)分泌 IL-10、TGF-β等具抑制性的細(xì)胞因子，抑制Thl細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及其活性，調(diào)控免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，減輕對(duì)機(jī)體組織損傷作用[13-14]，AS疾病中有關(guān)Treg細(xì)胞的研究存在上、下調(diào)結(jié)論的不一致性，王朋等[15]對(duì)AS患者Treg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果呈上調(diào)與Crispin等關(guān)于自身免疫性疾病外周血Treg細(xì)胞表達(dá)水平下降的結(jié)論恰好相反[16]。本研究結(jié)果顯示，AS患者外周血Treg細(xì)胞低于健康對(duì)照組，支持Crispin等的結(jié)論。本研究小組所得結(jié)果顯示，AS患者體內(nèi)存在Th1、Th2、Treg數(shù)量的失衡。Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)量減少，Th1細(xì)胞增加，破壞了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，從而引起免疫應(yīng)答異常[17]。故在 AS的治療中，糾正Th1、Th2、Treg細(xì)胞量的失衡、調(diào)節(jié)其數(shù)量和功能狀態(tài)可能是治療AS的有效方法。

綜上所述，本研究表明，AS患者存在 Th1、Th2、Treg細(xì)胞的失衡。伴隨著AS疾病活動(dòng)度的增高，由Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能在患者體內(nèi)表達(dá)亢進(jìn)，而Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用減弱。聯(lián)合檢測(cè)AS患者外周血Th1、Th2、Treg細(xì)胞，對(duì)AS發(fā)病機(jī)制研究、病情變化以及治療監(jiān)測(cè)可能會(huì)成為較好的檢測(cè)項(xiàng)目，可能為AS診療提供新思路。

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