王作龍，鐘乃風，馬 莉＊＊

(1.貴陽醫(yī)學院附院中心實驗室，貴州貴陽 550004;2.貴陽醫(yī)學院生物與工程學院生物技術教研室，貴州貴陽 550004)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種與HLA-B27有明顯相關性的全身性自身免疫性疾病，一般以骶髂關節(jié)為首發(fā)部位，逐漸累及人類各種軟骨組織、脊柱及四肢關節(jié)[1]。AS發(fā)病機制目前尚不清楚，近年來有多種假說被提出，諸如遺傳假說、免疫假說、細菌感染假說、DNA甲基化，未折疊蛋白反應假說等[2-3]。免疫系統(tǒng)的異常是自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展和預后的中心環(huán)節(jié)，已有文獻報道在AS疾病中，人類T細胞亞群的失衡起關鍵作用[4]。依據(jù)CD4+T細胞分化和功能將其分為輔助性 T細胞 1(Th1)、輔助性 T細胞 2(Th2)，以及發(fā)揮負調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)等亞群。已有不少研究發(fā)現(xiàn)AS患者外周血Th1細胞明顯增高和Treg、Th2細胞減低，但同時對Th1、Th2及Treg細胞在AS患者外周血中的檢測，報道較少，在AS患者中是否存在Th1/Th2/Treg失衡，以及這種失衡對AS的相關性，本研究通過檢測AS患者外周血中Th1(CD3+CD8-INF-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)、Treg(CD4+CD127LOWCD125+)細胞[5]，分析 Th1、Th2、Treg細胞數(shù)量改變與AS發(fā)生、發(fā)展的相關性，以期了解AS的免疫平衡狀態(tài)，為AS的臨床診斷及治療提供新思路新方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

78例AS患者，男65性例，女性13例，17～53歲，平均(26+7.8)歲，AS疾病的診斷，符合1984年紐約修訂標準，HLA-B27均為陽性，均未經(jīng)任何治療[6]。排除標準:(1)合并其他慢性病;(2)明顯血液學指標異常;(3)其他自身免疫性疾病;(4)免疫抑制類藥物治療史;(5)免疫相關性疾病;(6)肝、腎功能異常。采集標本前，患者均自愿簽署知情同意書，填寫病例調(diào)查表以及Bath AS功能指數(shù)(BASFI)、Bath AS病情活動指數(shù)(BASDAI)表格。依據(jù)Bath AS病情活動指數(shù)，將AS組分為低活動性AS組(BASDI＜4分，44例)、高活動性 AS組(BASDI≥4分，34例)，兩組間年齡及性別構成差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.815)。選取30名健康體檢者作為正常對照組，其中男16名、女14名，15～52歲，平均年齡(25±8)歲 ，無HIV感染及重大疾病史。AS組與正常對照組之間性別構成及年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.773)。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有AS患者及正常對照組受檢者均于上午8∶00～10∶00空腹抽取靜脈血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，2 h內(nèi)用于 Th1、Th2、Treg細胞檢測。

1.2.2 細胞體外刺激活化 取上述經(jīng)EDTA-K2抗凝的靜脈血，用淋巴細胞液分離密度梯度離心法獲取單個核細胞，用RPMI 1640調(diào)整細胞濃度至2×106/mL接種于6孔培養(yǎng)板，加入PMA和Io，使終濃度分別為1和1.7 μg/mL。然后置于37℃的5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，刺激培養(yǎng)4～6 h。以上試劑均購自美國BD公司。

1.2.3 CD69的檢測 通過檢測CD3+CD8-T淋巴細胞膜表面的CD69表達，監(jiān)測激活效果。當CD69表達＞90%(圖1)方可進行Th1、Th2細胞的檢測。

1.2.4 Th1、Th2、細胞檢測 取兩支試管，一個標記為同型對照管，另一個為測試管，分別加入CD3-FITC、CD8-PECy7 抗體各 20 μL，再加入 50 μL 已刺激培養(yǎng)后的全血，混勻，室溫避光孵育15 min;溶血，PBS洗滌2次，加入破膜劑1 mL，進行胞內(nèi)細胞因子染色，分別加入對應抗體標記同型對照(-)及Th1/Th2(+)，混勻，室溫避光孵育15 min;PBS洗滌1次后，上機檢測。Th1、Th2、細胞的結果分別以 CD3+CD8-IFN-r+、CD3+CD8-IL-4+細胞的百分率表示。

1.2.5 Treg細胞檢測 取兩支試管，第一管做同型對照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗體20 μL，第二管加入 Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 uL，再分別加入 EDTA-K2抗凝外周血50 μL，混勻，室溫避光孵育15 min，其余步驟同 Th1，上機檢測。Treg細胞的結果以CD4+CD127LOWCD25+細胞的百分率表示。流式細胞儀為美國BD公司生產(chǎn)的Canto II。

1.3 統(tǒng)計學處理

流式分析數(shù)據(jù)采用Diva分析軟件，統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。以(±s)表示各組檢測指標數(shù)據(jù)。采用 t檢驗進行組間比較;采用Pearson相關分析方法進行相關性分析，當|r|＞0.7 時為高度相關，當 0.4≤|r|＜0.7 時為中度相關，當|r|＜0.4時為低度相關。當 P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

高活動性AS組和AS組外周血Th2細胞均低于低活動性AS組和正常對照組(P均＜0.05，表1、圖3)，且高活動性AS組明顯低于低活動性AS組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義;而低活動性AS組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AS組外周血Treg細胞與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);AS低活動性組外周血Treg細胞與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);AS高活動性組外周血Treg細胞明顯低于正常對照組和AS低活動性組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。見表1、圖4。

表1 AS組及正常對照組外周血Th1、Th2、Treg細胞量的比較(%)Tab.1 Comparison of quantity of Th1，Th2 and Treg cells between the AS group and normal control group in peripheral blood

2.1 外周血中Th1、Th2及Treg亞群

AS組外周血Th1細胞均明顯高于正常對照組(P 均 ＜0.01，表 1、圖 2)，高活動性 AS 組明顯高于低活動性AS組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖1 流式細胞術檢測CD3+CD8-CD69+細胞(CD69細胞)設門分析方法Fig.1 CD3+CD8-CD69+cells detected by flow cytometry

圖2 Th1細胞所占的百分數(shù)Fig.2 The percent of Th1 cells(%)

圖3 Th2細胞所占的百分數(shù)(%)Fig.3 The percent of Th2 cells(%)

圖4 Treg細胞所占的百分數(shù)(%)Fig.4 The percent of Treg cells(%)

2.2 外周血Th1、Th2、Treg細胞與AS活動性的相關性

AS患者外周血Th1細胞比例與Bath強直性脊柱炎病情活動指數(shù)(BASDI)呈正相關，Th2細胞和Treg細胞與BASDI均呈負相關。見表2。

表2 AS患者外周血Th1、Th2、Treg細胞與BASDI的相關性分析Tab.2 The analysis for correlation of Th1，Th2 and Treg cells in peripheral blood of AS patients with BASDI

3 討論

AS被認為與遺傳、環(huán)境，感染相關一種嚴重的慢性炎性風濕性疾病[7]。目前發(fā)現(xiàn)在AS這類自身免疫性疾病的發(fā)病機制中，免疫功能紊亂起重要作用，如 B淋巴細胞亞群[8]、CD4+T淋巴細胞異常[9]。初始 CD4+T 細胞，在 IFN-γ、IL-2 等細胞因子的誘導下，分化為Th1細胞，在IL-4等細胞因子的誘導下分化為Th2細胞，在TGF-β、IL-10等細胞因子的誘導下分化為Treg細胞[10]。

Th1 細胞分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-β 等細胞因子，主要參與介導細胞免疫應答、細胞毒性T細胞和巨噬細胞活化，以及遲發(fā)型超敏反應，增強其抗感染能力，同時可抑制過度的Th2細胞介導的免疫反應。本研究結果顯示，AS患者Th1細胞增高，符合與Nurieva等[11]對AS患者Th1、Th2細胞的研究結果。本研究還發(fā)現(xiàn)，患者外周血Th1細胞與BASDI(即AS活動性)呈明顯正相關。低活動性AS組(也就是AS早期)，就出現(xiàn)Th1細胞數(shù)量的異常增高，且伴隨AS活動性的增高，Th1細胞異常增高的程度更為顯著。由此可見，AS是一類由Th1細胞亞群驅動的疾病，且與疾病活動性高度相關。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-6等細胞因子，主要參與抗體介導的免疫應答、B細胞和嗜酸性粒細胞活化以及 IgE的生成，Th2細胞分泌的IL-4是重要的抑制炎癥因子，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)Ig類別的轉化。本研究結果顯示，AS患者Th2細胞與AS活動性呈負相關，且在AS患者外周血中，表現(xiàn)為細胞百分含量的降低。低活動性AS組外周血Th2細胞稍降低，但與對照正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);伴隨著AS患者病情的進展，導致高活動性AS組Th2細胞明顯低于正常對照組(P＜0.01)。提示在AS早期，在AS患者自身免疫系統(tǒng)中，Th2細胞抑制炎癥作用并不不明顯，而AS晚期，Th1細胞的增高，可能導致了Th2細胞的大幅度降低，Th1和Th2產(chǎn)生的細胞因子間，存在交叉調(diào)節(jié)作用。由Th1細胞分泌的IFN-γ可抑制Th2細胞分化增殖。本研究在CD4+Th細胞亞群中，Th1細胞介導的炎癥反應在AS患者中為主導，Th1細胞的明顯增多導致Th2細胞負調(diào)節(jié)作用減弱，產(chǎn)生了過多的炎性細胞因子，致使抗炎介質(zhì)的缺乏，Th1激活程度低下，Th2激活程度增強，最終導致Th1/Th2失衡。并且這種失衡是一種漸進的趨勢。

Treg細胞根據(jù)來源分為天然 Treg細胞(nT-regs)和誘導性 Treg細胞(iTregs)，nTregs由胸腺細胞自然分化發(fā)育而來，iTregs由外周成熟的CD4+CD25-T淋巴細胞受到特異性抗原刺激并在細胞因子的誘導下轉化而來，具自身特異性，免疫負性調(diào)節(jié)功能[12]，外周的 iTregs 通過分泌 IL-10、TGF-β等具抑制性的細胞因子，抑制Thl細胞產(chǎn)生細胞因子及其活性，調(diào)控免疫應答的強度，減輕對機體組織損傷作用[13-14]，AS疾病中有關Treg細胞的研究存在上、下調(diào)結論的不一致性，王朋等[15]對AS患者Treg細胞檢測結果呈上調(diào)與Crispin等關于自身免疫性疾病外周血Treg細胞表達水平下降的結論恰好相反[16]。本研究結果顯示，AS患者外周血Treg細胞低于健康對照組，支持Crispin等的結論。本研究小組所得結果顯示，AS患者體內(nèi)存在Th1、Th2、Treg數(shù)量的失衡。Th2細胞和Treg細胞數(shù)量減少，Th1細胞增加，破壞了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，從而引起免疫應答異常[17]。故在 AS的治療中，糾正Th1、Th2、Treg細胞量的失衡、調(diào)節(jié)其數(shù)量和功能狀態(tài)可能是治療AS的有效方法。

綜上所述，本研究表明，AS患者存在 Th1、Th2、Treg細胞的失衡。伴隨著AS疾病活動度的增高，由Th1細胞介導的細胞免疫功能在患者體內(nèi)表達亢進，而Th2細胞和Treg細胞介導的免疫抑制作用減弱。聯(lián)合檢測AS患者外周血Th1、Th2、Treg細胞，對AS發(fā)病機制研究、病情變化以及治療監(jiān)測可能會成為較好的檢測項目，可能為AS診療提供新思路。

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