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        檢測不同活動期強直性脊柱炎患者外周血Th1、Th2和Treg細胞的意義*

        2015-09-27 05:46:18王作龍鐘乃風
        貴州醫(yī)科大學學報 2015年4期
        關鍵詞:活動性外周血細胞因子

        王作龍,鐘乃風,馬 莉**

        (1.貴陽醫(yī)學院附院中心實驗室,貴州貴陽 550004;2.貴陽醫(yī)學院生物與工程學院生物技術教研室,貴州貴陽 550004)

        強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種與HLA-B27有明顯相關性的全身性自身免疫性疾病,一般以骶髂關節(jié)為首發(fā)部位,逐漸累及人類各種軟骨組織、脊柱及四肢關節(jié)[1]。AS發(fā)病機制目前尚不清楚,近年來有多種假說被提出,諸如遺傳假說、免疫假說、細菌感染假說、DNA甲基化,未折疊蛋白反應假說等[2-3]。免疫系統(tǒng)的異常是自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展和預后的中心環(huán)節(jié),已有文獻報道在AS疾病中,人類T細胞亞群的失衡起關鍵作用[4]。依據(jù)CD4+T細胞分化和功能將其分為輔助性 T細胞 1(Th1)、輔助性 T細胞 2(Th2),以及發(fā)揮負調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)等亞群。已有不少研究發(fā)現(xiàn)AS患者外周血Th1細胞明顯增高和Treg、Th2細胞減低,但同時對Th1、Th2及Treg細胞在AS患者外周血中的檢測,報道較少,在AS患者中是否存在Th1/Th2/Treg失衡,以及這種失衡對AS的相關性,本研究通過檢測AS患者外周血中Th1(CD3+CD8-INF-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)、Treg(CD4+CD127LOWCD125+)細胞[5],分析 Th1、Th2、Treg細胞數(shù)量改變與AS發(fā)生、發(fā)展的相關性,以期了解AS的免疫平衡狀態(tài),為AS的臨床診斷及治療提供新思路新方法。

        1 材料與方法

        1.1 研究對象

        78例AS患者,男65性例,女性13例,17~53歲,平均(26+7.8)歲,AS疾病的診斷,符合1984年紐約修訂標準,HLA-B27均為陽性,均未經(jīng)任何治療[6]。排除標準:(1)合并其他慢性病;(2)明顯血液學指標異常;(3)其他自身免疫性疾病;(4)免疫抑制類藥物治療史;(5)免疫相關性疾病;(6)肝、腎功能異常。采集標本前,患者均自愿簽署知情同意書,填寫病例調(diào)查表以及Bath AS功能指數(shù)(BASFI)、Bath AS病情活動指數(shù)(BASDAI)表格。依據(jù)Bath AS病情活動指數(shù),將AS組分為低活動性AS組(BASDI<4分,44例)、高活動性 AS組(BASDI≥4分,34例),兩組間年齡及性別構成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.815)。選取30名健康體檢者作為正常對照組,其中男16名、女14名,15~52歲,平均年齡(25±8)歲 ,無HIV感染及重大疾病史。AS組與正常對照組之間性別構成及年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.773)。

        1.2 方法

        1.2.1 標本采集 所有AS患者及正常對照組受檢者均于上午8∶00~10∶00空腹抽取靜脈血2~3 mL于EDTA-K2抗凝管中,2 h內(nèi)用于 Th1、Th2、Treg細胞檢測。

        1.2.2 細胞體外刺激活化 取上述經(jīng)EDTA-K2抗凝的靜脈血,用淋巴細胞液分離密度梯度離心法獲取單個核細胞,用RPMI 1640調(diào)整細胞濃度至2×106/mL接種于6孔培養(yǎng)板,加入PMA和Io,使終濃度分別為1和1.7 μg/mL。然后置于37℃的5%CO2細胞培養(yǎng)箱中,刺激培養(yǎng)4~6 h。以上試劑均購自美國BD公司。

        1.2.3 CD69的檢測 通過檢測CD3+CD8-T淋巴細胞膜表面的CD69表達,監(jiān)測激活效果。當CD69表達>90%(圖1)方可進行Th1、Th2細胞的檢測。

        1.2.4 Th1、Th2、細胞檢測 取兩支試管,一個標記為同型對照管,另一個為測試管,分別加入CD3-FITC、CD8-PECy7 抗體各 20 μL,再加入 50 μL 已刺激培養(yǎng)后的全血,混勻,室溫避光孵育15 min;溶血,PBS洗滌2次,加入破膜劑1 mL,進行胞內(nèi)細胞因子染色,分別加入對應抗體標記同型對照(-)及Th1/Th2(+),混勻,室溫避光孵育15 min;PBS洗滌1次后,上機檢測。Th1、Th2、細胞的結果分別以 CD3+CD8-IFN-r+、CD3+CD8-IL-4+細胞的百分率表示。

        1.2.5 Treg細胞檢測 取兩支試管,第一管做同型對照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗體20 μL,第二管加入 Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 uL,再分別加入 EDTA-K2抗凝外周血50 μL,混勻,室溫避光孵育15 min,其余步驟同 Th1,上機檢測。Treg細胞的結果以CD4+CD127LOWCD25+細胞的百分率表示。流式細胞儀為美國BD公司生產(chǎn)的Canto II。

        1.3 統(tǒng)計學處理

        流式分析數(shù)據(jù)采用Diva分析軟件,統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。以(±s)表示各組檢測指標數(shù)據(jù)。采用 t檢驗進行組間比較;采用Pearson相關分析方法進行相關性分析,當|r|>0.7 時為高度相關,當 0.4≤|r|<0.7 時為中度相關,當|r|<0.4時為低度相關。當 P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        高活動性AS組和AS組外周血Th2細胞均低于低活動性AS組和正常對照組(P均<0.05,表1、圖3),且高活動性AS組明顯低于低活動性AS組(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義;而低活動性AS組與正常對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。AS組外周血Treg細胞與正常對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);AS低活動性組外周血Treg細胞與健康對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);AS高活動性組外周血Treg細胞明顯低于正常對照組和AS低活動性組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.01)。見表1、圖4。

        表1 AS組及正常對照組外周血Th1、Th2、Treg細胞量的比較(%)Tab.1 Comparison of quantity of Th1,Th2 and Treg cells between the AS group and normal control group in peripheral blood

        2.1 外周血中Th1、Th2及Treg亞群

        AS組外周血Th1細胞均明顯高于正常對照組(P 均 <0.01,表 1、圖 2),高活動性 AS 組明顯高于低活動性AS組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

        圖1 流式細胞術檢測CD3+CD8-CD69+細胞(CD69細胞)設門分析方法Fig.1 CD3+CD8-CD69+cells detected by flow cytometry

        圖2 Th1細胞所占的百分數(shù)Fig.2 The percent of Th1 cells(%)

        圖3 Th2細胞所占的百分數(shù)(%)Fig.3 The percent of Th2 cells(%)

        圖4 Treg細胞所占的百分數(shù)(%)Fig.4 The percent of Treg cells(%)

        2.2 外周血Th1、Th2、Treg細胞與AS活動性的相關性

        AS患者外周血Th1細胞比例與Bath強直性脊柱炎病情活動指數(shù)(BASDI)呈正相關,Th2細胞和Treg細胞與BASDI均呈負相關。見表2。

        表2 AS患者外周血Th1、Th2、Treg細胞與BASDI的相關性分析Tab.2 The analysis for correlation of Th1,Th2 and Treg cells in peripheral blood of AS patients with BASDI

        3 討論

        AS被認為與遺傳、環(huán)境,感染相關一種嚴重的慢性炎性風濕性疾病[7]。目前發(fā)現(xiàn)在AS這類自身免疫性疾病的發(fā)病機制中,免疫功能紊亂起重要作用,如 B淋巴細胞亞群[8]、CD4+T淋巴細胞異常[9]。初始 CD4+T 細胞,在 IFN-γ、IL-2 等細胞因子的誘導下,分化為Th1細胞,在IL-4等細胞因子的誘導下分化為Th2細胞,在TGF-β、IL-10等細胞因子的誘導下分化為Treg細胞[10]。

        Th1 細胞分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-β 等細胞因子,主要參與介導細胞免疫應答、細胞毒性T細胞和巨噬細胞活化,以及遲發(fā)型超敏反應,增強其抗感染能力,同時可抑制過度的Th2細胞介導的免疫反應。本研究結果顯示,AS患者Th1細胞增高,符合與Nurieva等[11]對AS患者Th1、Th2細胞的研究結果。本研究還發(fā)現(xiàn),患者外周血Th1細胞與BASDI(即AS活動性)呈明顯正相關。低活動性AS組(也就是AS早期),就出現(xiàn)Th1細胞數(shù)量的異常增高,且伴隨AS活動性的增高,Th1細胞異常增高的程度更為顯著。由此可見,AS是一類由Th1細胞亞群驅動的疾病,且與疾病活動性高度相關。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-6等細胞因子,主要參與抗體介導的免疫應答、B細胞和嗜酸性粒細胞活化以及 IgE的生成,Th2細胞分泌的IL-4是重要的抑制炎癥因子,在體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用,調(diào)節(jié)Ig類別的轉化。本研究結果顯示,AS患者Th2細胞與AS活動性呈負相關,且在AS患者外周血中,表現(xiàn)為細胞百分含量的降低。低活動性AS組外周血Th2細胞稍降低,但與對照正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);伴隨著AS患者病情的進展,導致高活動性AS組Th2細胞明顯低于正常對照組(P<0.01)。提示在AS早期,在AS患者自身免疫系統(tǒng)中,Th2細胞抑制炎癥作用并不不明顯,而AS晚期,Th1細胞的增高,可能導致了Th2細胞的大幅度降低,Th1和Th2產(chǎn)生的細胞因子間,存在交叉調(diào)節(jié)作用。由Th1細胞分泌的IFN-γ可抑制Th2細胞分化增殖。本研究在CD4+Th細胞亞群中,Th1細胞介導的炎癥反應在AS患者中為主導,Th1細胞的明顯增多導致Th2細胞負調(diào)節(jié)作用減弱,產(chǎn)生了過多的炎性細胞因子,致使抗炎介質(zhì)的缺乏,Th1激活程度低下,Th2激活程度增強,最終導致Th1/Th2失衡。并且這種失衡是一種漸進的趨勢。

        Treg細胞根據(jù)來源分為天然 Treg細胞(nT-regs)和誘導性 Treg細胞(iTregs),nTregs由胸腺細胞自然分化發(fā)育而來,iTregs由外周成熟的CD4+CD25-T淋巴細胞受到特異性抗原刺激并在細胞因子的誘導下轉化而來,具自身特異性,免疫負性調(diào)節(jié)功能[12],外周的 iTregs 通過分泌 IL-10、TGF-β等具抑制性的細胞因子,抑制Thl細胞產(chǎn)生細胞因子及其活性,調(diào)控免疫應答的強度,減輕對機體組織損傷作用[13-14],AS疾病中有關Treg細胞的研究存在上、下調(diào)結論的不一致性,王朋等[15]對AS患者Treg細胞檢測結果呈上調(diào)與Crispin等關于自身免疫性疾病外周血Treg細胞表達水平下降的結論恰好相反[16]。本研究結果顯示,AS患者外周血Treg細胞低于健康對照組,支持Crispin等的結論。本研究小組所得結果顯示,AS患者體內(nèi)存在Th1、Th2、Treg數(shù)量的失衡。Th2細胞和Treg細胞數(shù)量減少,Th1細胞增加,破壞了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),從而引起免疫應答異常[17]。故在 AS的治療中,糾正Th1、Th2、Treg細胞量的失衡、調(diào)節(jié)其數(shù)量和功能狀態(tài)可能是治療AS的有效方法。

        綜上所述,本研究表明,AS患者存在 Th1、Th2、Treg細胞的失衡。伴隨著AS疾病活動度的增高,由Th1細胞介導的細胞免疫功能在患者體內(nèi)表達亢進,而Th2細胞和Treg細胞介導的免疫抑制作用減弱。聯(lián)合檢測AS患者外周血Th1、Th2、Treg細胞,對AS發(fā)病機制研究、病情變化以及治療監(jiān)測可能會成為較好的檢測項目,可能為AS診療提供新思路。

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