馬　笮，胡姍姍，周　洋，孫昊量，李　慧，栗巧玲（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院一分院.口腔科；.眼科黑龍江牡丹江570）

·基礎(chǔ)研究·

CD44v3和CD44v5在口腔黏液表皮樣癌中的表達(dá)及臨床意義

馬笮1，胡姍姍2，周洋1，孫昊量1，李慧1，栗巧玲1
（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院一分院1.口腔科；2.眼科黑龍江牡丹江157011）

目的：通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面黏附分子CD44v3和CD44v5在口腔黏液表皮樣癌（Oral mucoepidermoid carcinoma,OMC）中的表達(dá)，探討二者與OMC的發(fā)生、病理分級(jí)和臨床分期的關(guān)系。方法：利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)40例OMC石蠟標(biāo)本中CD44v3和CD44v5蛋白表達(dá)，并且分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：CD44v3和CD44v5在OMC中表達(dá)率與正常對(duì)照組相比有顯著升高（＜0.05)，不同病理分級(jí)、臨床分期之間并無(wú)顯著性差異(＞0.05)。結(jié)論：在OMC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，CD44v3和CD44v5可能起著重要作用，CD44v3、CD44v5可能成為了解OMC病變發(fā)生發(fā)展生物學(xué)行為及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移重要的生物學(xué)指標(biāo)之一。

口腔黏液表皮樣癌；CD44v3；CD44v5；免疫組化

口腔黏液表皮樣癌（Oral mucoepidermoid carcinoma，OMC）是臨床十分常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤之一[1]，臨床研究表明其細(xì)胞學(xué)行為與腫瘤的生物學(xué)行為高度相似。臨床上將這一類(lèi)廣泛分布的細(xì)胞表面黏附分子均稱(chēng)為CD44，由于CD44亞型是拼接有外顯子的變異亞型碼，因此研究人員將CD44家族中含有變異型外顯子v3和v5編碼序列的CD44分子依次命名為CD44v3和CD44v5，且其多在上皮源性或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，故臨床報(bào)道較多，報(bào)道多集中討論于其與膽囊癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌、腸癌以及口腔鱗狀細(xì)胞癌等癌癥的相關(guān)性[2-3]。通過(guò)以CD44v為關(guān)鍵詞搜索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)其中關(guān)于CD44v3和CD44v5與口腔黏液表皮樣癌的報(bào)道十分罕見(jiàn)，但相關(guān)學(xué)者的研究表明CD44v3和CD44v5對(duì)口腔黏液表皮樣癌的診斷和治療具有一定的臨床價(jià)值[4]。故本課題應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)CD44v3和CD44v5在OMC中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并探討兩者表達(dá)的臨床意義。

1　材料和方法

1.1材料

選取2009年-2014年在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院治療的40例口腔黏液表皮樣癌患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理切片確診；②病理科均有帶有癌旁組織的原發(fā)口腔黏液表皮樣癌蠟塊存檔；③所有患者均僅實(shí)施手術(shù)治療；④所有患者均未于術(shù)前接受放療等輔助性治療措施。其中男26例，女14例；年齡28～79歲，平均年齡(45±6)歲。依據(jù)2005年世界衛(wèi)生組織制定的有關(guān)口腔黏液表皮樣癌病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有患者進(jìn)行病理分級(jí)。同時(shí)，選取同時(shí)期的10例正常涎腺組織作為對(duì)照組。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試劑：本研究以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)樣本組織中的CD44v3及CD44v5表達(dá)，檢測(cè)所需的CD44v3抗體、CD44v5抗體、免疫組化試劑盒均購(gòu)自福州博爾生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2.2免疫組化染色：①采用二甲苯進(jìn)行蠟切片脫蠟，并以梯度酒精充分脫去樣本中的水分，充分脫水后采用清水及封閉液沖洗10min，并采用檸檬酸高壓修復(fù)樣本，持續(xù)2min；②以PBS緩沖液沖洗樣本3min，并反復(fù)沖洗3次，沖洗后于每份樣本中加入50μl一抗，并將處理的樣本置于4℃試驗(yàn)箱恒溫過(guò)夜；③將樣本取出，并用PBS緩沖液持續(xù)沖洗5min，并連續(xù)沖洗3次，沖洗完成仔細(xì)吸除樣本表面殘留的PBS緩沖液，并在每份樣本中滴加50μl放大劑（鼠或兔），室溫孵育10min；④用PBS緩沖液持續(xù)沖洗樣本3min，并連續(xù)沖洗3次，沖洗完成仔細(xì)吸除樣本表面殘留的PBS，并在每份樣本中滴加50μl多聚酶結(jié)合物，于室溫下持續(xù)孵育10min；⑤用PBS緩沖液持續(xù)沖洗樣本3min，并連續(xù)沖洗3次，沖洗完成仔細(xì)吸除樣本表面殘留的PBS緩沖液，并在每份樣本中滴加50μl新鮮配制的DAB溶液，并將樣本置于顯微鏡下仔細(xì)觀(guān)察3～5min，用自來(lái)水反復(fù)沖洗樣本后，用蘇木素對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染，采用0.1%HCl分化樣本，并用氨水將樣本返藍(lán)；⑥采用梯度酒精充分脫去樣本中的水分并干燥后，采用透明二甲苯中性樹(shù)膠將樣本封固。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

本研究采用雙盲法進(jìn)行結(jié)果判定，所有樣本均由兩名病理學(xué)專(zhuān)業(yè)人員對(duì)樣本進(jìn)行閱片和計(jì)數(shù)。陽(yáng)性樣本特征：CD44v3及CD44v5蛋白均為棕黃色，且因具有定位于細(xì)胞膜表面的特性，故多以連續(xù)的棕黃色線(xiàn)狀或者帶狀分布于陽(yáng)性細(xì)胞周?chē)鶾5]。閱片人員隨即選取10個(gè)高倍視野進(jìn)行觀(guān)察，當(dāng)細(xì)胞膜表面出現(xiàn)完整的色板時(shí)則視為陽(yáng)性樣本，仔細(xì)分辨并記錄該視野下陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)（%）。樣本陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)：①膜染色較間質(zhì)背景染色深，②細(xì)胞染色數(shù)量≥5%即為陽(yáng)性。采用半定量積分法進(jìn)行結(jié)果判斷，閱片人員應(yīng)以染色較好的10個(gè)高倍視野進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：①計(jì)數(shù)著色細(xì)胞比例，l/3以下為1分，1/3～2/3為2分，2/3以上為3分；②計(jì)數(shù)著色程度，無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；③將同一樣本的上述兩種計(jì)分結(jié)果相乘，a.0分則為陰性（－）；b.1～4分則為弱陽(yáng)性（+）；c.＞4分則為強(qiáng)陽(yáng)性（++）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果

2.1 OMC分化程度與CD44v3、CD44v5表達(dá)相關(guān)性分析

OMC分化程度依次為高、中、低的患者中，CD44v3陽(yáng)性率依次為45.5%、61.6%、81.3%，故隨著OMC分化程度增高，CD44v3表達(dá)率依次下降，其兩者間未呈明顯的正相關(guān)性（＞0.05）；OMC分化程度依次為高、中、低的患者中，CD44v5陽(yáng)性率依次為45.5%、69.2%、87.5%，由表1可看出，CD44v3在高、中、低分化中OMC的表達(dá)隨著分化程度越低其陽(yáng)性率上升，故隨著OMC分化程度增高，CD44v5表達(dá)率依次下降，但其表達(dá)與OMC分化程度無(wú)明顯關(guān)系。CD44v5在高、中、低分化中OMC的表達(dá)陽(yáng)性率分別為45.5%、69.2%、87.5%，且兩者間未呈正相關(guān)性（＜0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)請(qǐng)見(jiàn)表1。

2.2OMC患者中CD44v3、CD44v5表達(dá)的相關(guān)性分析

在28例CD44v3陽(yáng)性表達(dá)OMC標(biāo)本中，有26例樣本同時(shí)為CD44v5陽(yáng)性表達(dá)，約占樣本總數(shù)的92.8%；在15例CD44v3陰性O(shè)MC標(biāo)本中，有11例樣本同時(shí)為CD44v5陰性表達(dá)，約占樣本總數(shù)的73.3%；Sperman分析結(jié)果表明兩者之間呈正相關(guān)（=0.724，＜0.01），詳細(xì)數(shù)據(jù)請(qǐng)見(jiàn)表2。

2.3OMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CD44v3、CD44v5表達(dá)相關(guān)性分析

表1　OMC分化程度與CD44v3、CD44v5表達(dá)相關(guān)性分析

表2　OMC患者中CD44v3、CD44v5表達(dá)的相關(guān)性分析

表3　OMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CD44v3、CD44v5表達(dá)相關(guān)性分析

由表3可知，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OMC樣本中CD44v3及CD44v5陽(yáng)性表達(dá)率依次為72.4%、79.3%，均明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本中的18.1%（＜0.05）、18.1%（＜0.01），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳細(xì)數(shù)據(jù)請(qǐng)見(jiàn)表3。

3　討論

臨床研究表明，11號(hào)染色體短臂（p14－13）上存在著細(xì)胞膜表面糖蛋白被單基因編碼的CD44分子。由于CD44基因外顯子不同的表達(dá)方式，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的不同類(lèi)型，這兩種外顯子被稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)型CD44S和變異型CD44v[6]。

最新臨床研究結(jié)果表明，CD44v可通過(guò)以下幾種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移：①促進(jìn)高內(nèi)皮小靜脈與淋巴細(xì)胞結(jié)合；②對(duì)淋巴細(xì)胞歸巢或激活具有正性作用[7]；③能夠促進(jìn)淋巴組織再循環(huán)；④參與并促進(jìn)淋巴細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程；⑤自身是周?chē)?xì)胞或細(xì)胞間質(zhì)的組成成分之一；⑥具有類(lèi)似纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等的粘附作用；⑦可直接參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、離肝素結(jié)合因子的產(chǎn)生和透明質(zhì)酸的降解[8-10]。

研究人員發(fā)現(xiàn)CD44v3和CD44v5兩種亞型的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物均為棕黃色顆粒，結(jié)合本研究結(jié)果以及相關(guān)文獻(xiàn)可知，CD44v3多高表達(dá)于OMC組織，而低表達(dá)于正常口腔黏膜；但CD44v5卻多高表達(dá)于正?？谇火つぃ捅磉_(dá)于OMC組織。此外，CD44v3和CD44v5與不同病理分級(jí)的OMC組織中表達(dá)強(qiáng)度均不存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）。

本研究通過(guò)對(duì)我院40例OMC患者樣本分析表明，OMC不同病理分級(jí)患者間以及OMC淋巴轉(zhuǎn)移患者以及為轉(zhuǎn)移患者間CD44v3和CD44v5的表達(dá)率均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.05），且OMC淋巴轉(zhuǎn)移患者表達(dá)率高于未轉(zhuǎn)移患者，結(jié)果表明CD44v3及CD44v5陽(yáng)性表達(dá)率和OMC的轉(zhuǎn)移呈一定的正相關(guān)性。上述結(jié)果為臨床判斷OMC是否發(fā)生了淋巴轉(zhuǎn)移提供了更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。今后的試驗(yàn)將在擴(kuò)大樣本例數(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合更精確的判斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行更深入的研究。同時(shí)可更細(xì)致的分析CD44v3及CD44v5陽(yáng)性表達(dá)量在OMC診治中的臨床價(jià)值。

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編輯/張惠娟

Expression and clinical significance of CD44v3 and CD44v5 in oral mucoepidermoid carcinoma

MA Zuo1,HU Shan-shan2,ZHOU Yang1,SUN Hao-liang1,LI Hui1,LI Qiao-ling1
(1.Department of Stomatology,2.Department of Ophthalmology,Red Flag Hospital,Mudanjiang Medical University,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China)

ObjectiveTo detect the expression of the cell surface adhesion molecule CD44v3 and CD44v5 in oral mucoepidermoid carcinoma(OMC),and to explore the relationship between the two and the occurrence,pathological grade and clinical stage of OMC.Methods Immunohistochemical staining was used to detect the exprssion of CD44v3 and CD44v5 protein in 40 cases of OMC in paraffin embedded specimens,and were statistically analyzed.Results CD44v3 and CD44v5 expression rates in OMC compared with the control group was significantly higher(<0.05),no significant differences between pathological grade,and clinical stage(>0.05).Conclusion OMC in the lymph node metastasis,CD44v3 and CD44v5 may play an important role,CD44v3,CD44v5 may be one of the important indexesto understand the transfer of OMC lesion development and the biological behavior of lymph node.

oralmucoepidermoid carcinoma;CD44v3;CD44v5;immunohistochemistry

R739.85

A

1008-6455（2015）04-0032-03

2014-11-28

2015-01-22