趙敏玲，劉仲榮，陳胡林，朱英杰，嚴苗苗，范秀針

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科廣東廣州510010；2.廣州中醫(yī)藥大學廣東廣州510405)

·基礎(chǔ)研究·

鹽酸川芎嗪在長波紫外線誘導人皮膚成纖維細胞氧化應(yīng)激中的作用

趙敏玲1,2，劉仲榮1，陳胡林1，朱英杰1，嚴苗苗1，范秀針1

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科廣東廣州510010；2.廣州中醫(yī)藥大學廣東廣州510405)

目的：探討鹽酸川芎嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP）在長波紫外線（Utraviolet A,UVA）誘導人皮膚成纖維細胞(Human dermis fibroblasts,HDF)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)中的保護作用。方法：原代培養(yǎng)HDF細胞，用不同濃度TMP分別作用未經(jīng)UVA照射以及經(jīng)UVA多次照射的HDF細胞24 h，48 h，72 h，CCK-8法檢測TMP對HDF細胞體外增殖的作用；流式細胞術(shù)檢測不同濃度TMP對多次UVA照射后HDF細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)總量的影響。結(jié)果：TMP在一定濃度范圍內(nèi)對HDF細胞的體外增殖無明顯促進或者毒性作用，但對多次UVA照射后HDF細胞的體外增殖有一定的促進作用，且與濃度有一定的相關(guān)性，與UVA對照組比較有統(tǒng)計學意義（＜0.05）；TMP可清除UVA多次照射引起的HDF細胞內(nèi)ROS累積，與UVA對照組比較有統(tǒng)計學差異（＜0.05），其作用效果能達未經(jīng)UVA照射的水平。結(jié)論：鹽酸川芎嗪(TMP)對長波紫外線誘導HDF細胞氧化應(yīng)激有一定的保護作用。

HDF細胞；鹽酸川芎嗪；增殖；ROS

紫外線長期慢性反復(fù)照射可使皮膚出現(xiàn)松弛、干燥粗糙、皺紋增多等光老化的表現(xiàn)[1]。皮膚光老化現(xiàn)象與成纖維細胞(Human dermis fibroblasts, HDF)的數(shù)量減少及分泌合成功能下降或異常有關(guān)。日光中的長波紫外線（Utraviolet A,UVA）能穿透表皮，直達真皮層，直接損失成纖維細胞。UVA反復(fù)照射可使成纖維細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)堆積，超過了其清除能力，打破氧化與抗氧化平衡，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)一系列程序化的細胞反應(yīng)[2]，甚至調(diào)控衰老相關(guān)的信號通路，促進細胞衰老的發(fā)生。有研究表明ROS在細胞內(nèi)的堆積是皮膚光老化發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)[2]。

川芎嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine, TMP)，是川芎中的主要活性生物堿。研究表明[3]川芎能有效地抑制氧自由基產(chǎn)生，保護膜脂質(zhì)不被氧化，防止DNA損傷發(fā)生。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)鹽酸川芎嗪具有可清除ROS[4]，抗氧化應(yīng)激[5]，抗腫瘤[6]等作用。

本實驗研究鹽酸川芎嗪對UVA多次照射后成纖維細胞的體外增殖及胞內(nèi)ROS的影響，試圖為其進一步成為潛在的光防護成分并應(yīng)用于抗皮膚光老化提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1主要儀器和試劑

UVA臺式紫外線治療儀（上海希格瑪公司，SS-04A）；UVA輻射探測儀（上海希格碼公司）；酶標儀（Thermo）；流式細胞儀（Guawa）；ROS試劑盒（Life Sciences）；高糖DMEM(含10%胎牛血清，Hyclone)，CCK-8試劑盒（Sigma），鹽酸川芎嗪注射液購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥準字H20030553。

1.2細胞培養(yǎng)

HDF為原代培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，取自門診健康青年男（年齡18～23歲）包皮環(huán)切術(shù)后進行標本分離的包皮組織，采用酶消化法分離留取HDF細胞進行原代培養(yǎng)，連續(xù)傳代，取第3～10代的細胞進行實驗。

1.3細胞分組和UVA照射

實驗分組：20μg·ml-1鹽酸川芎嗪組、50μg·ml-1鹽酸川芎嗪組、100μg·ml-1鹽酸川芎嗪組、UVA組（高糖DMEM培養(yǎng)液+UVA照射）、假照射組（高糖DMEM培養(yǎng)液，置UVA治療儀下不開電源），未給藥組。HDF細胞接種于直徑30mm的培養(yǎng)皿中，接種密度為1×104個/皿，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至剛開始出現(xiàn)融合時進行UVA照射，利用UVA輻射探測儀檢測UVA的強度調(diào)整照射時間使照射劑量為10J，每日1次，連續(xù)照射5次。照射前吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，再以PBS覆蓋細胞，置于冰上照射。

1.4CCK-8法檢測細胞體外增殖活性

取未經(jīng)UVA照射及5次UVA照射后的HDF細胞，調(diào)整濃度為3.0×103個/ml接種于96孔板，每孔100μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24h,48h,72h后，吸去每孔舊培養(yǎng)液（避免藥物吸光性影響OD值），加入新鮮培養(yǎng)液（均無藥物）100μl/孔，每孔再加入10μlCCK-8試劑，置37℃培養(yǎng)箱中避光孵育2h后，酶標儀測定在450nm波長處每孔的OD值。實驗重復(fù)5次。

1.5流式細胞術(shù)檢測HDF細胞內(nèi)ROS

取未經(jīng)UVA照射及5次UVA照射48h后的HDF細胞，調(diào)整濃度為104個/ml，每1ml細胞懸液加入400μl DCFH-DA(10μM)，以每孔200μl的量接種于96孔板中，每組設(shè)雙復(fù)孔，置37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20min上流式細胞儀，488nm為激發(fā)波長，525nm為發(fā)射波長。實驗重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1鹽酸川芎嗪對未經(jīng)UVA照射的HDF細胞體外增殖活性的影響

與未給藥組（Non-administered）比較，鹽酸川芎嗪各濃度組的細胞增殖活性在24h,48h,72h并無明顯差異（均＞0.05）。鹽酸川芎嗪在一定濃度范圍內(nèi)對HDF細胞的體外增殖活性無明顯促進或者毒性作用。見表1，圖1。

2.2鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF細胞體外增殖活性的影響

與假照射組（Sham-irradiated）比較，鹽酸川芎嗪各濃度組細胞增殖活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05）。與UVA組比較，UVA+鹽酸川芎嗪100μg·ml-1組的差異有統(tǒng)計學意義（均＜0.05）。鹽酸川芎嗪各組隨濃度的增加,細胞增殖活性逐漸增加，且有一定濃度依賴性。鹽酸川芎嗪對UVA照射后的HDF細胞表現(xiàn)出一定的光保護作用。見表2。

表1　不同濃度鹽酸川芎嗪對未經(jīng)UVA照射的HDF細胞體外增殖活性的影響

表1　不同濃度鹽酸川芎嗪對未經(jīng)UVA照射的HDF細胞體外增殖活性的影響

注：*與Non-administered比較＜0.05。

組別Non-administered TMP20μg·ml-1TMP50μg·ml-1TMP100μg·ml-1頻數(shù)OD值5 5 5 5 24 h 0.460±0.046 0.399±0.086 0.456±0.020 0.432±0.010 48 h 0.707±0.067 0.832±0.007 0.777±0.038 0.792±0.053 72 h 0.922±0.063 0.965±0.268 1.111±0.070 1.041±0.077

表2　鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF體外增殖活性的影響

表2　鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF體外增殖活性的影響

注：*與Sham-irradiated組比較＜0.05；△與UVA組比較＜0.05

組別UVA組UVA+TMP 20μg·ml-1UVA+TMP 50μg·ml-1UVA+TMP 100μg·ml-1Sham-irradiated頻數(shù)OD值5 5 5 5 5 24 h 0.486±0.021*0.534±0.007*0.526±0.044*0.515±0.080*△0.708±0.051 48 h 0.631±0.041*0.673±0.086 0.779±0.044*0.778±0.063△0.853±0.054 72 h 0.786±0.039*0.779±0.056*0.825±0.040*0.923±0.050*△1.086±0.096

圖1　不同濃度鹽酸川芎嗪對未經(jīng)UVA照射的HDF細胞體外增殖活性的影響

圖2　鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF細胞內(nèi)ROS的水平影響

2.3鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF細胞內(nèi)ROS的影響

與假照射組比較，UVA+不同濃度川芎嗪組細胞內(nèi)ROS水平無統(tǒng)計學差異，而假照射組與UVA組有統(tǒng)計學差異（＜0.05）。與UVA組比較，其余各組細胞內(nèi)ROS水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均＜0.05），但無無明顯濃度依賴性。鹽酸川芎嗪能在一定濃度范圍內(nèi)清除反復(fù)UVA照射引起HDF細胞內(nèi)的ROS累積，以濃度為50μg·ml-1、100μg·ml-1時明顯，且能清除至與假照射組接近的ROS水平。見表3、圖2。

表3　鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF細胞內(nèi)ROS的水平影響

表3　鹽酸川芎嗪對5次UVA照射后HDF細胞內(nèi)ROS的水平影響

注：*：Sham-irradiated組與UVA組有統(tǒng)計學差異（*＜0.05）；△：UVA組與其余各組比較均有統(tǒng)計學差異（△＜0.05）

組別UVA組UVA+TMP20μg·ml-1UVA+TMP50μg·ml-1UVA+TMP100μg·ml-1Sham-irradiated頻數(shù)3 3 3 3 3 ROS(%) 39.31±6.79*31.47±3.19△23.64±3.51△25.41±4.52△24.01±5.62△

3　討論

皮膚光老化是紫外線長期反復(fù)慢性照射引起的皮膚損害，不但會影響美觀，而且會影響皮膚的功能，甚至成為某些皮膚病的相關(guān)因素。皮膚光老化臨床上表現(xiàn)為皮膚干燥、深皺紋、粗糙、皮革樣、點狀色素沉著或色素減退斑點、膚色灰黃。組織學上的改變以表皮萎縮、黑色素細胞數(shù)量減少且分布局限、膠原纖維、彈力纖維組織結(jié)構(gòu)缺失、無定形彈力蛋白樣物質(zhì)的沉積以及毛細血管擴張為特點。成纖維細胞是真皮層的最重要細胞，在對抗皮膚光老化的發(fā)生發(fā)展方面起著重要作用，它可產(chǎn)生膠原蛋白、纖維黏連蛋白、糖胺聚糖等細胞外基質(zhì)，維持皮膚的彈性及水分。長波紫外線的主要作用靶點是成纖維細胞。長期反復(fù)紫外線照射引起成纖維細胞生長緩慢，細胞分泌及合成功能下降或異常，同時誘導細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反復(fù)，導致細胞內(nèi)活性氧（ROS）的堆積?；钚匝跏侵敢活惥邆溲趸芰Φ牡碾x子、分子和自由基，可分為自由基成分(如超氧自由基和經(jīng)自由基)及非自由基成分(單線態(tài)氧和過氧化氫)。生理情況下細胞內(nèi)活性氧的生成與代謝處于平衡狀態(tài)，但在病理狀態(tài)下會出現(xiàn)失衡從而對細胞造成損傷。ROS可刺激細胞表面細胞因子和生長因子受體的活化導致相應(yīng)細胞內(nèi)信號蛋白募集，從而激活多種信號傳導通路，導致多種轉(zhuǎn)錄因子（如NF-kB），活化的NF-kB會轉(zhuǎn)移到細胞核中，然后在這些特定基因的促進區(qū)或增強區(qū)與它的同源DNA結(jié)合位點相結(jié)合，從而開始基因的轉(zhuǎn)錄激活表達，它可使衰老相關(guān)蛋白p53的表達上調(diào)或增加其穩(wěn)定性[7-8]，并促進基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)表達[9-10]，降解皮膚內(nèi)膠原纖維，從而促進皮膚衰老現(xiàn)象的發(fā)生。

近年來針對氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗皮膚光老化或光保護劑研究非常多[11]，如人參皂甙Rd[12]、雷公藤紅素[13]、紅景天[14]等均有明顯抗氧化及抗衰老作用。鹽酸川芎嗪（TMP）是從傳統(tǒng)中藥川芎中提取出來的活性生物單體，其清除氧自由基的作用早被證實[4]，在心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用早有研究，但尚未有文獻報道其對皮膚的作用。本研究選用鹽酸川芎嗪作為研究對象，以UVA多次照射HDF細胞，探討鹽酸川芎嗪對UVA誘導HDF細胞發(fā)生氧化應(yīng)激的保護作用。結(jié)果顯示不同濃度鹽酸川芎嗪對HDF細胞的體外增殖活性無明顯作用。有文獻報道[15-16]，鹽酸川芎嗪能抑制成纖維細胞的體外增殖且在濃度為250μg·ml-1時成纖維細胞增殖抑制率為50%，但其在濃度為100μg·ml-1以內(nèi)的作用不明顯，本研究中選取的藥物作用濃度為0～100μg·ml-1，與雷水生、曹靈等[16-17]研究結(jié)論大致相符。更重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸川芎嗪對多次UVA照射后的HDF細胞增殖活性有促進作用，具有一定的劑量依賴性，同時檢測HDF細胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸川芎嗪能清除UVA照射后的HDF細胞內(nèi)ROS，清除效果能接近假照射組的ROS總量值。這種現(xiàn)象提示在紫外線誘導成纖維細胞損傷，生長緩慢甚至停滯的過程中，ROS可能起到重要的作用。鹽酸川芎嗪可能通過清除細胞內(nèi)ROS，減輕細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度，間接促進反復(fù)UVA照射后的HDF細胞增殖，發(fā)揮了一定的保護作用。

皮膚老化是在細胞衰老的基礎(chǔ)上發(fā)生的。細胞衰老涉及復(fù)制衰老和應(yīng)激誘導的提前衰老。長期慢性紫外線照射成纖維細胞可引起細胞應(yīng)激性衰老，其過程涉及氧化應(yīng)激、細胞自噬、凋亡等一系列過程[17]。細胞內(nèi)ROS的累積是其中一個重要環(huán)節(jié)。本研究證實鹽酸川芎嗪能在一定程度上改善反復(fù)UVA照射引起HDF細胞的增殖緩慢，清除細胞內(nèi)ROS。因此，筆者推測鹽酸川芎嗪可能為潛在的光保護劑，甚至可能具有抗皮膚光老化的作用，這些推測有待進一步研究論證。

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編輯/張惠娟

The Role of 2,3,5,6-tetramethylpyrazine in protecting human dermis fibroblasts from UVA

ZHAO Min-ling1,2,LIU Zhong-rong1,CHEN Hu-lin1,ZHU Ying-jie1,YAN Miao-miao1,FAN Xiu-zhen1
（1.Department of Dermatology,General Hospital of Guangzhou Military Area Command of Chinese PLA,Guangzhou 510010,Guangdong,China;2.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405,Guangdong,China）

ObjectiveThestudywaspurposedtoresearchtheprotectionof2,3,5,6-tetramethylpyrazine(TMP)against ROS in human dermis fibroblasts induced by UVA.Methods We first isolated human dermis fibroblasts(HDF)from human prepuce for primary culture,then exposed HDF under repeated ultraviolet A radiation.After 24h,48h,72h,we test the effects of TMP with different concentrations on HDF in vitro proliferation.We also detected the total ROS in HDF after repeated UVA by flow cytometry.ResultsTMP made no effects on HDF in vitro proliferation,but had a certain role on HDF proliferation after repeated UVA,which had a certain correlation with concentration,and there was a significant difference when compared with the UVA control group (＜0.05).TMP was able to eliminate ROS induced by UVA,which had a significant difference when compared with the UVA control group(＜0.05)and return the total ROS to that before UVA radiation.ConclusionTMP was capable of protecting HDF from UVA,which might be related to the elimination of ROS.

HDF;2,3,5,6-tetramethylpyrazine;proliferation;ROS

R758.1

A

1008-6455（2015）03-0030-05

國家自然科學基金（30972652），廣東省自然科學計劃項目（2013B021800053）

劉仲榮，副主任，副主任醫(yī)師，主要研究方向為皮膚光老化激光美容；通聯(lián)：廣東省廣州市廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院皮膚科，郵編：510010

2014-11-27

2015-01-09