李 敏，秦新月

（1.重慶市第七人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，重慶400054；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，重慶400016）

水通道蛋白4抗體（anti－aquaporins 4，AQP4－Ab）是近年來發(fā)現(xiàn)的對(duì)于視神經(jīng)脊髓炎（nuromylitis optica，NMO）有較高特異性及敏感性的檢驗(yàn)指標(biāo)［1］，可用于與多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的鑒別。臨床上對(duì)水通道蛋白4抗體的檢測(cè)方法的研究較為廣泛，目前的檢測(cè)方法有細(xì)胞免疫共沉淀法、放射免疫共沉淀法、組織間接免疫熒光檢測(cè)、細(xì)胞免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等［2］，各種方法優(yōu)缺點(diǎn)不同。我院采用了后3種方法對(duì)125例患者的血清及腦脊液進(jìn)行檢測(cè)分析，以此為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2009年1月至2014年12月收治的58例多發(fā)性硬化患者（MS組）及67例視神經(jīng)脊髓炎患者（NMO組），年齡37－54歲，平均45.4±8.6歲，其中男38例，女87例。納入排除標(biāo)準(zhǔn)：①兩組患者分別符合NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］及 MS診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；②由兩名以上主任醫(yī)師做出診斷；③排除同時(shí)合并其他器質(zhì)性或功能性神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；④排除疾病緩解期患者或1月內(nèi)有免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素治療者。50例健康受試者（對(duì)照組）均來自我院健康體檢中心。本次研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，健康受試者、患者及家屬均簽署知情同意書。

3組間性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，NMO組患者與MS組患者間性別組成、年齡、起病年齡、病程均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。

表1 兩組患者一般情況比較

1.2 樣本采集與處理

所有共175例研究對(duì)象采集非抗凝血2ml，離心（4℃2 500r/min，20min）后去上清液，于－20℃保存?zhèn)溆谩?25例NMO與MS患者入院后行腰椎穿刺檢查，留取腦脊液標(biāo)本0.2ml與血清一同保存。

1.3 檢測(cè)方法

組織間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immunofluorescence assay，IIF）：參照檢測(cè)方法［5］，應(yīng)用視神經(jīng)（猴）/AQP4試劑盒（歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司，德國(guó)，批號(hào)：FAll2c－1005－1）檢測(cè) AQP4－IgG，具體操作步驟及陽性結(jié)果以說明書為標(biāo)準(zhǔn)。

細(xì)胞免疫熒光法（cell—based assay，CBA）：具體操作步驟參照檢測(cè)方法［6］，待檢測(cè)的血清及腦脊液標(biāo)本與HEK－293T－AQP4細(xì)胞共同孵育后，采用熒光顯微鏡觀察。由于AQP4為跨膜糖蛋白，即細(xì)胞膜出現(xiàn)綠色熒光為陽性結(jié)果。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme－linked im－munosorbent assay，ELISA）：采用抗AQP4抗體檢測(cè)試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），具體操作步驟參照說明書。用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光度。陽性結(jié)果以說明書為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，NMO組及MS組一般資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)比較不同檢測(cè)方法間陽性率，敏感性及特異性差異。P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較不同方法檢測(cè)血清及腦脊液中AQP4－Ab陽性檢出率

3種方法檢測(cè)對(duì)照組血清中AQP4－Ab的表達(dá)陽性率均為0.0%。比較3種方法在NMO組與MS組患者血清及腦脊液中AQP4－Ab的陽性檢出率，NMO組患者的陽性檢出率有差異（P＝0.029，P＝0.001），其中，CBA對(duì) AQP4－Ab的陽性檢出率最高，分別為73.1%及85.1%。詳見表2。

表2 不同方法檢測(cè)血清及腦脊液中AQP4－Ab陽性檢出率比較［例（%）］

2.2 比較不同方法檢測(cè)血清及腦脊液中AQP4－Ab敏感性及特異性

比較3種方法的敏感性：CBA＞IIF＞ELISA；比較3種方法的特異性：CBA＞ELISA＞IIF。其中，3種方法的敏感性有差異（χ2＝7.115，P＝0.029；χ2＝14.443，P＝0.001），3種方法的特異性無差異。

3 討論

視神經(jīng)脊髓炎主要累及視神經(jīng)與脊髓，是一種炎性脫髓鞘性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為亞急性發(fā)病的不同程度的視力障礙、雙下肢癱瘓、感覺及二便障礙［7］，由于其與多發(fā)性硬化在臨床癥狀上具有相似性，臨床上對(duì)兩者是否為同一疾病的不同亞型存在廣泛的爭(zhēng)議。近年來隨著視神經(jīng)脊髓炎病例報(bào)道的增多以及相關(guān)研究的進(jìn)展［8－10］，視神經(jīng)脊髓炎在臨床經(jīng)過、神經(jīng)影像學(xué)、血清學(xué)、免疫病理學(xué)等方面均與多發(fā)性硬化表現(xiàn)不一致。視神經(jīng)脊髓炎受累的脊髓節(jié)段比較長(zhǎng)，MRI特點(diǎn)為病灶長(zhǎng)度在3個(gè)或3個(gè)以上椎體節(jié)段，稱之為縱向擴(kuò)展性橫貫性脊髓炎，與之不同的是，多發(fā)性硬化的病灶以大腦半球?yàn)橹?，脊髓病灶很少超過2個(gè)椎體.且多位于脊髓周邊［11］。然而，由于視神經(jīng)脊髓炎早期可出現(xiàn)腦部病灶，其與多發(fā)性硬化的預(yù)后有很大不同，因此，尋找能夠幫助早期診斷、鑒別的生物學(xué)標(biāo)志將有助于對(duì)患者的治療。

AQP4－Ab又稱視神經(jīng)脊髓炎特異性抗體（nuromylitis optica－IgG，NMO－IgG）是 Lennon［12］等于2004年發(fā)現(xiàn)的，存在與視神經(jīng)脊髓炎患者的血清及腦脊液中，對(duì)于早期診斷鑒別視神經(jīng)脊髓炎與多發(fā)性硬化具有重要意義。AQP4是分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高選擇性的水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白，其主要表達(dá)于腦膜表面、室管膜和腦室周圍，其他在下丘腦視上核、小腦、海馬齒狀回、中韁核、脈絡(luò)叢上皮、視網(wǎng)膜及視神經(jīng)也可有表達(dá)［13］，不同部位的AQP4發(fā)揮各自功能，共同參與腦脊液的分泌、分布與重吸收，此外，對(duì)于腦內(nèi)滲透壓、K＋的平衡及腦水腫的病理機(jī)制祈禱重要調(diào)節(jié)作用［14］。AQP4抗體能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘和壞死，誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞的損害［15］。

本次試驗(yàn)主要研究了組織間接免疫熒光檢測(cè)、細(xì)胞免疫熒光法及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法這三種方法檢測(cè)視神經(jīng)脊髓炎患者血清及腦脊液中AQP4－Ab表達(dá)的臨床應(yīng)用。通過試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，3種方法中細(xì)胞免疫熒光法對(duì)AQP4－Ab的陽性檢出率最高，分別為血清中73.1%及腦脊液中85.1%，與文獻(xiàn)符合［16］，3 種方法的 敏感性比 較 為 CBA＞IIF＞ELISA，證明細(xì)胞免疫熒光法對(duì)AQP4－Ab的檢出最有優(yōu)勢(shì)。此外，健康對(duì)照組血清中無一例檢出AQP4－Ab，MS組患者血清及腦脊液中AQP4－Ab的陽性檢出率無差異（P＞0.05），而NMO患者血清及腦脊液中 AQP4－Ab的陽性檢出率有差異（P＝0.029，P＝0.001），均在一定程度上顯示出 AQP4－Ab是NMO的特異性抗體，符合上述描寫。

綜上所述，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)脊髓炎患者的血清及腦脊液中水通道蛋白4抗體的陽性率、敏感性高，適于臨床應(yīng)用。

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