張彥東，鄔 巍，馬 寧，劉 濤，王 凱，姜振寧

（吉林大學第一醫(yī)院 風濕免疫科，吉林 長春130021）

人微小病毒B19（Human Parvovirus B19，HPV B19）是一種DNA病毒，也是與人類最密切相關(guān)的微小病毒［1］。本病毒是由Yvonne Cossart等于1975年在標記B19號HBsAg對照的血清中首次鑒定出一種微病毒顆粒。在實驗室檢測中最早利用特異性血清學檢測，后又建立了PCR、熒光定量PCR［2］和基因芯片［3］等靈敏度較高的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 病毒基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司、限制性內(nèi)切酶Hinf I、Dpn I和T4DNA連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品，dNTPs、DL2000DNA Marker、甜菜堿（betaine）為Sigma公司產(chǎn)品；Bst DNA聚合酶大片段為NEB公司產(chǎn)品。

1.2 病毒DNA的抽提 參照DNA提取試劑盒的說明書進行病毒DNA的抽提。

1.3 引物的設(shè)計與合成 利用LAMP引物在線設(shè)計軟件Primer explorer，根據(jù)登陸在GenBank中B19的VP2進行比較，選擇基因保守區(qū)域，設(shè)計引物，篩選后選擇2對引物，F(xiàn)3/B3為外游引物，F(xiàn)IP/BIP為內(nèi)游引物。同時利用oligo軟件設(shè)計1對PCR引物，上游為upper，下游為lower。各引物序列為：

所有序列由深圳華大生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR方法 按照說明書進行常規(guī)PCR方法對病毒DNA鑒定。

1.5 LAMP檢測方法 對25μl反應(yīng)體系中的MgSO4（25mmol/L）以及反應(yīng)時間進行優(yōu)化。調(diào)整試驗中 MgSO4（25mmol/L）的用量，MgSO4（25 mmol/L）則為6μl，7μl，8μl；并且優(yōu)化 LAMP的反應(yīng)時間，分別調(diào)整為60min，90min，120min。反應(yīng)體系中其他用量為：2μl的DNA樣品、2.5μl的Bst DNA 聚合酶緩沖液（10×）、2μl dNTPs（10 mmol/L），1μl的 Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（5 mol/L）、對應(yīng)于VP2基因的4條引物各濃度F3/B3為pmol/μl、BIP/FIP為40pmol/μl，加 H2O 補足至25μl?；靹颍?5℃，1－2h后80℃，2min，水浴。1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察試驗結(jié)果。

1.6 LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定和序列測定 將LAMP產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶BanII進行酶切鑒定，并以此為模板進行普通PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化，得到陽性克隆，并且送深圳華大公司基因測序。方法參照試劑盒說明書。

1.7 LAMP的靈敏性與特異性評價 將抽提所得的總DNA 10倍稀釋至10－5.并使用紫外分光光度計測定稀釋后各個梯度的DNA濃度，分別為100 ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg。對上述各濃度DNA用LAMP方法進行檢測，并用PCR方法同時擴增進行靈敏性的比較。

按照與B19病毒相同的條件對乙型肝炎病毒（HBV），巨細胞病毒（HCMV）進行DNA的提取，以及優(yōu)化后的LAMP檢測。

2 結(jié)果

2.1 B19病毒的PCR結(jié)果 PCR結(jié)果可見在100 bp與250bp之間有一條陽性條帶（圖1），與設(shè)計的198bp產(chǎn)物片段符合。

2.2 MgSO4以及反應(yīng)時間的優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明 MgSO4（25mmol/L）為6μl（圖2），最適反應(yīng)時間為60min（圖3）。

2.3 酶切鑒定及測序結(jié)果 用Hinf I和Dpn I限制性內(nèi)切酶對LAMP產(chǎn)物進行雙酶切鑒定，結(jié)果表明，本實驗中的LAMP產(chǎn)物片段大小與理論值相符。

2.4 LAMP的靈敏性和特異性結(jié)果 常規(guī)PCR產(chǎn)物稀釋至10pg時，PCR無結(jié)果，LAMP結(jié)果為陽性（圖4），證明其靈敏性高于普通PCR。對HBV和HCMV進行特異性判斷，LAMP檢測結(jié)果HBV和HCMV是陰性（圖4），B19病毒為陽性，證明LAMP檢測方法具有特異性。

圖1 b19病毒PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 不同濃度Mg2＋離子的LAMP檢測結(jié)果

圖3 不同反應(yīng)時間的LAMP檢測結(jié)果

圖4 b19病毒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3 討論

3.1 人類細小病毒B19是一種DNA病毒，體積最小、結(jié)構(gòu)簡單，有報道該病毒與感染致過敏性紫癜、川崎?。?］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［5］、結(jié)節(jié)性多動脈炎、韋格納肉芽腫病和關(guān)節(jié)炎等均相關(guān)。但由于人類細小病毒B19很難在常規(guī)細胞系中繁殖，也無法在建立動物模型中復制，因此對該病毒的研究有一定的限制。臨床上通常根據(jù)其抗體的檢測來判斷患者是否感染過B19病毒，對于抗原的檢測最常見的方法就是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），但該方法需要特殊的儀器、摸索適合PCR條件以及較長的循環(huán)時間，并不適用于臨床檢測。近年來，各種等溫檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用［6］。本實驗利用2000年日本Notomi博士發(fā)明的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP），在國內(nèi)首次建立人B19病毒LAMP檢測方法，實驗僅需要一臺恒溫水浴鍋就可以在60min內(nèi)完成整個檢測過程，并且實驗證明其敏感性高于普通PCR方法。真正達到了簡單、高效的診斷檢測。

3.2 LAMP檢測方法中引物設(shè)計是其核心部分，也是技術(shù)關(guān)鍵 此方法是用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域。實驗的條件是60－65℃，此溫度是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。另外，很多文獻報道因為LAMP檢測方法的靈敏度過高，實驗中很容易出現(xiàn)假陽性。本實驗中為避免此狀況，將進行擴增的空間與進行電泳的空間嚴格隔離，并酶切鑒定結(jié)果的特異性。如果在臨床上應(yīng)用，則可以添置濁度儀或加入熒光染料就可避免此問題。

［1］Torok TJ.Parvovlru8B19and Human disease［J］.Adv Intern Med，1992，37：431.

［2］趙國強，胡 軍，冷 弘，等.熒光定量PCR檢測B19病毒方法的建立［J］.鄭州大學學報，2005，5：380.

［3］Lu liang，MA Wen－li，WANG Hong－min，et al.Quick preparations of human parvovirus B19micro array probes using PCR［J］.第一軍醫(yī)大學學報，2003，23（11）：1121.

［4］鄭 巖.40例川崎病患兒微小病毒B19感染的近期分析［J］.中國實驗診斷學，2008，6：789.

［5］魯智勇，沈小雁，薛 峰，等.細小病毒B19感染與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性研究［J］.中華風濕病學雜志，2006，10（7）：430.

［6］張福明，李 凡，張淑芹.網(wǎng)狀分枝擴增法檢測EB病毒基因及臨床應(yīng)用研究［J］.中國實驗診斷學，2006，3：221.