尚志剛，郭瓊，李甜，白生賓，鐘近潔，秦紋，馮樹(shù)梅

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)新疆烏魯木齊830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室新疆烏魯木齊830000）

人脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

尚志剛1，郭瓊2，李甜2，白生賓2，鐘近潔2，秦紋2，馮樹(shù)梅2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)新疆烏魯木齊830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室新疆烏魯木齊830000）

目的：探討人脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)并鑒定。方法：采用膠原酶法消化人脂肪組織，培養(yǎng)原代脂肪干細(xì)胞，通過(guò)多種方法檢測(cè)鑒定。結(jié)果：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭形，并呈旋渦狀或放射狀排列；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線為典型的“S”形，細(xì)胞倍增時(shí)間為26h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD29、CD105、CD44為陽(yáng)性；CD45為陰性；成脂誘導(dǎo)分化的細(xì)胞經(jīng)油紅O染色為陽(yáng)性，成骨誘導(dǎo)分化后茜素紅染色亦為陽(yáng)染。結(jié)論：通過(guò)獲取人腹部脂肪組織進(jìn)體外分離培養(yǎng)及鑒定，證實(shí)其為脂肪干細(xì)胞。

脂肪干細(xì)胞；分離培養(yǎng)；鑒定

脂肪干細(xì)胞是近年來(lái)組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)，目前認(rèn)為，它是一群成纖維細(xì)胞樣的基質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能［1］，體外實(shí)驗(yàn)證明脂肪干細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)后，具有成脂分化能力、成骨分化能力、成軟骨細(xì)胞分化能力、成骨骼肌細(xì)胞分化能力、成心肌細(xì)胞分化能力、成內(nèi)皮細(xì)胞分化能力、成神經(jīng)細(xì)胞分化能力等，是一種具有多譜系、多胚層分化能力的干細(xì)胞［2-3］。本研究將手術(shù)獲取的人脂肪組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，將傳代后的細(xì)胞進(jìn)行多向分化誘導(dǎo)，為進(jìn)一步研究脂肪干細(xì)胞的分化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1　第4代、第6代、第11代脂肪干細(xì)胞形態(tài)

1　資料和方法

1.1人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）的分離及培養(yǎng)

通過(guò)外科手術(shù)獲得患者的腹部脂肪，排除脂肪瘤等疾病，已簽署同意書。將得到的脂肪組織剪成0.1cm×0.1cm×0.1cm大小組織，用0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后置入瓶中，以4倍脂肪組織體積的膠原酶I消化，反復(fù)將脂肪組織剪碎至糊狀后，37℃搖勻30min，用250μl尼龍紗網(wǎng)將消化后的脂肪組織過(guò)濾入離心管中，1000r/min離心30 min，棄去上清液和懸浮的脂肪碎塊，沉淀重懸于0.075mmol/L氯化鉀，靜置10min后離心，棄去上清，沉淀重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，移入培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%CO2溫箱，以100%濕度進(jìn)行培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞鋪滿約90%培養(yǎng)皿底部面積后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.2人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）的生物學(xué)特性檢測(cè)

1.2.1人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）的形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)間脂肪干細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)、形態(tài)。

1.2.2人脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取第8代脂肪干細(xì)胞，消化法消化細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.5× 105/L接種于24孔板，每天隨機(jī)取4孔細(xì)胞消化、記數(shù)，連續(xù)7d，以時(shí)間為X坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為Y坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1）。

1.2.3干細(xì)胞表面標(biāo)記物：取第3代細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14、CD29、CD44、CD45、CD105。

1.2.4成脂肪誘導(dǎo)及鑒定：加入成脂誘導(dǎo)液，配置含10%FBS的HG-DMEM培養(yǎng)液，在配制完成的HGDMEM培養(yǎng)液中，加入1μM地塞米松，10μg/ml胰島素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；準(zhǔn)備6孔培養(yǎng)板，將第三代脂肪干細(xì)胞按照2×104個(gè)/cm2的規(guī)格接種于原始HG-DMEM培養(yǎng)液中待細(xì)胞長(zhǎng)至基本融合后，每2～3d換液。誘導(dǎo)兩周后，油紅O染液染色，倒置顯微鏡下觀察染色情況，拍照。

1.2.5成骨誘導(dǎo)及鑒定：加入成骨誘導(dǎo)液，準(zhǔn)備含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液，在備好的α-MEM培養(yǎng)液中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、地塞米松，50μmol/L抗壞血酸。準(zhǔn)備6孔培養(yǎng)板，將第三代脂肪干細(xì)胞按照5×103個(gè)/cm2的規(guī)格接種于原始α-MEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2和100%濕度溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至基本融合后，更換上述制備完成的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。28d后再進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色，用倒置顯微鏡下觀察染色情況，拍照。

2　結(jié)果

2.1人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)24h后就有少量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈短小的梭形或多角形，均為單細(xì)胞核，胞核位于細(xì)胞中央。24h首次換液，換液后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。3～4d后可見(jiàn)細(xì)胞梭形逐漸變長(zhǎng)，多角形逐漸消失，2～3d天左右換液，經(jīng)傳代10次后，觀察形態(tài)較飽滿、均一，多呈長(zhǎng)梭性。增殖速度在1:2的分種率下在72h左右可長(zhǎng)滿，形態(tài)亦多呈長(zhǎng)梭性，呈極性排列。

2.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞倍增時(shí)間為26h。細(xì)胞增殖曲線呈現(xiàn)典型的“S”形，在接種的前3d內(nèi)細(xì)胞處于生長(zhǎng)的停滯期，3～6d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，6d達(dá)到生長(zhǎng)峰，至第7天細(xì)胞增殖速度明顯變緩，進(jìn)入增殖平臺(tái)期（圖2）。

圖2　脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)

用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞表面分子CD14、CD29、CD44、CD45、CD105。其中CD14和CD45為陰性，CD29、CD44、CD105為陽(yáng)性（圖3）。

2.4成脂誘導(dǎo)分化

細(xì)胞貼壁100%匯合后，加入間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液，成脂誘導(dǎo)約3d后，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)小脂滴。隨后細(xì)胞的外形也逐漸由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形或多邊形，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量逐漸增加，并有相互融合的趨勢(shì)，經(jīng)油紅O染色顯示可見(jiàn)脂質(zhì)沉積（圖4）。

2.5成骨誘導(dǎo)分化

細(xì)胞貼壁約70%匯合后，加入間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后，細(xì)胞的形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸呈短梭形或多角形；誘導(dǎo)7d后，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞顆粒增多，細(xì)胞呈多角形；4周后，逐漸失去正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)（圖5）。

圖3　脂肪干細(xì)胞表面分子鑒定結(jié)果

3　討論

隨著分子生物技術(shù)和細(xì)胞生物技術(shù)的進(jìn)步，很多學(xué)者將目光投向了細(xì)胞治療技術(shù)，認(rèn)為這一全新的領(lǐng)域?qū)樵S多疾病的治療打開(kāi)嶄新的篇章［4］。有研究表明，利用間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)治療疾病時(shí)，平均每千克體重大約需要移植2×106個(gè)細(xì)胞［5］。具體到一些內(nèi)科疾病上，在心內(nèi)科，如果想利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)治療治療心肌梗死，醫(yī)生需要為每個(gè)患者移植的2.36×108個(gè)細(xì)胞；在消化內(nèi)科，如果想利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)治療治療克羅恩氏病時(shí)，醫(yī)生需要為每個(gè)患者移植約3× 107個(gè)細(xì)胞［6］。但是根據(jù)目前的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手段，要想得到5000個(gè)脂肪干細(xì)胞就會(huì)耗費(fèi)約一克的脂肪組織。鑒于實(shí)際治療上的要求，要想在臨床工作當(dāng)中取得滿意的治療效果，則必須對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行高質(zhì)量的體外擴(kuò)增。然而，干細(xì)胞的相關(guān)研究認(rèn)為，過(guò)多的傳代會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖和分化能力造成影響，這會(huì)影響干細(xì)胞特性［7-10］。與此相互印證的是臨床治療后長(zhǎng)期跟蹤的結(jié)果顯示，要想獲得更高的治療成功率，就要在治療時(shí)盡量選用接近原代的干細(xì)胞進(jìn)行移植接種。綜上所述，滿足臨床需求的干細(xì)胞擴(kuò)增方法是要盡量延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，在每一代培養(yǎng)中獲得更多的細(xì)胞。然而，對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行不傳代的長(zhǎng)期培養(yǎng)是非常困難的，但是脂肪干細(xì)胞能夠耐受接觸抑制［11］，有研究改良了傳統(tǒng)的5d傳代的干細(xì)胞培養(yǎng)方法，認(rèn)為每14d才進(jìn)行傳代反而能夠獲得更高質(zhì)量的干細(xì)胞。因此，實(shí)踐并探索各種脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，不斷積累經(jīng)驗(yàn)，有助于進(jìn)行后續(xù)對(duì)脂肪干細(xì)胞分化能力的控制研究提供實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)材料。

總之，在本次試驗(yàn)研究中，分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞形態(tài)正常，生長(zhǎng)曲線符合脂肪干細(xì)胞的特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD105、CD29、CD44為陽(yáng)性；CD45、CD14為陰性；培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞具有成脂分化和成骨分化的能力。根據(jù)以上檢測(cè)結(jié)果，可以確定該細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞。

圖5　茜素紅染色，鈣結(jié)節(jié)形成

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Isolation and identification of human adipose stem cells

SHANG Zhi-gang1，GUO Qiong2，LI Tian2，BAI Sheng-bing2，ZHONG Jin-jie2，QIN Wen2，
FENG Shu-mei2
（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China；2.Department of histo-embryology，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells（hADSCs）.Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro，the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover，flow cytometry and multi-lineage differentiation ability were identified.Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells，and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape，indicating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29，CD105，CD44，negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent.Conclusion HADSCs could be obtained from human abodemen adipose tissue through a series of isolation and identified methods.

human adipose stem cells；isolation；identification.

Q813.1

A

1008-6455（2015）08-0034-04

馮樹(shù)梅，女，副教授；主要研究方向：干細(xì)胞分化及其應(yīng)用；新疆醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，郵編：830000