常秀梅，張克榮，蔡潔琛，齊香薇，王書文

（廣東醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院廣東東莞523808）

·基礎(chǔ)研究·

EMP對人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原合成的影響

常秀梅，張克榮，蔡潔琛，齊香薇，王書文

（廣東醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院廣東東莞523808）

目的：觀察釉基質(zhì)蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）對牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（human gingival mesenchymal stem cells，hGMSCs）增殖和Ⅰ型膠原合成的影響。方法：分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測其間充質(zhì)干細(xì)胞特性STRO-1的表達(dá)，不同濃度EMPs，25 mg/L（A1組）、50 mg/L（A2組）、100 mg/L（A3組）、200 mg/L（A4組），對照組（A0組）10%FCS的DMEM溶液培養(yǎng)，MTT檢測EMPs對細(xì)胞增殖活性的影響。免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定細(xì)胞Ⅰ型膠原合成和圖像分析。結(jié)果：50～200mg/L表現(xiàn)出促hGMSCs增殖的作用，50 mg/L EMPs即可以顯著促進(jìn)hGMSCs的生長，但以100 mg/L EMPs的促增殖作用最強(qiáng)（與其余各組相比P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組膠原合成明顯強(qiáng)于對照組。其中，100mg/L促I型膠原（collagen typeⅠ，COLⅠ—合成最明顯，且隨時間變化。結(jié)論：EMP可促進(jìn)hGMSCs增殖和Ⅰ型膠原合成。

牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞；EMP；Ⅰ型膠原；增殖

成纖維細(xì)胞存在于人體的各種器官中，參與各種創(chuàng)傷的修復(fù)過程。近年來的研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞具有合成和改建胞外基質(zhì)的功能，并在組織修復(fù)過程中發(fā)揮支架的支撐功能。參與器官發(fā)育、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)，纖維化等多種疾病和和正常生命過程［1-4］，并具有干細(xì)胞特性［5］。牙齦成纖維細(xì)胞是否也具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，參與了牙周組織的再生修復(fù)，免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程？課題組分離牙齦成纖維細(xì)胞，鑒定其間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)，并觀察EMPs對其增殖和膠原合成的影響。初步分析hGMSCs在牙周再生中的作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

α-MEM培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶，膠原酶（Gibco，美國），超凈工作臺（蘇州凈安泰空氣技術(shù)有限公司），粗提型EMPs由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科惠贈，CO2孵箱（Heraeus，Germany），倒置相差顯微鏡照相系統(tǒng)（Olympus，日本），EMP（Biora，美國），兔抗人stro-1單克隆抗體，抗Ⅰ型膠原抗體，MTT （Sigma，美國）SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德公司），HPIAS-1000彩色圖像分析系統(tǒng)（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司），倒置顯微鏡和照相系統(tǒng)（Olympus，日本）。

1.2方法

1.2.1 hGMSCs培養(yǎng)：選取患者因正畸需要拔除的健康第一前磨牙牙齦組織。采用組織塊培養(yǎng)法獲取hGMSCs，當(dāng)細(xì)胞長面瓶底80%時傳代。

1.2.2細(xì)胞來源鑒定：取對數(shù)生長期的第二代人GMSCs制備細(xì)胞爬片（將生長狀態(tài)良好的F2代細(xì)胞接種至預(yù)先置有蓋玻片的培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時終止培養(yǎng)。取出蓋玻片，用0.01mol/L PBS清洗3遍，多聚甲醛固定30min。將固定好的細(xì)胞爬片用0.01mol/L PBS清洗3次，2.5ml/L Triton X-100處理15min，正常羊血清37℃封閉（孵育）30min，甩去血清。滴加1∶200稀釋的兔抗人STRO-1單克隆抗體，4℃濕盒過夜，37℃復(fù)溫1h，PBS振洗3次，5min/次。滴加1∶50稀釋的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS振洗3次，5min/次，DAB顯色，蘇木素胞核襯染，脫水封片。陰性對照用PBS代替一抗染色，其余步驟不變。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組分別用含2%FCS的DMEM將EMPs溶解并配置成25 mg/L（A1組）、50 mg/L（A2組）、100 mg/L（A3組）、200 mg/L（A4組）的4個濃度組培養(yǎng)。對照組（A0組）用含2%FCS的DMEM溶液培養(yǎng)。1.2.4含EMPs溶液培養(yǎng)細(xì)胞及制作細(xì)胞爬片：將生長狀態(tài)良好的F2代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為6×104/L，接種于預(yù)先放置了蓋玻片的24孔板，每孔加細(xì)胞懸液1ml，標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁時換無血清DMEM培養(yǎng)液靜息24 h，按EMPs實(shí)驗(yàn)分組換相應(yīng)培養(yǎng)液。在培養(yǎng)的第1天和第7天分別收集各組的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MTT法檢測不同濃度EMP對hGMSCs增殖的測定：取第3代GMSCs，2×106/L接種于96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞懸液。另設(shè)調(diào)零孔，加入100μl培養(yǎng)液。37℃，95%空氣，5%CO2，100%濕度培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，無血清DMEM培養(yǎng)液靜息24h。按實(shí)驗(yàn)分組換相應(yīng)含EMPs培養(yǎng)液，每組4孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加MTT溶液20μl，標(biāo)準(zhǔn)條件下孵育6h，洗凈孔內(nèi)液體，每孔加DMSO 150μl，振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長測吸光度值（A值）。

1.2.4免疫細(xì)胞化學(xué)染色：將固定好的細(xì)胞爬片用0.01mol/L PBS清洗3次，2.5ml/L Triton X-100處理15min，正常羊血清37℃封閉（孵育）30min，甩去血清。各組滴加抗Ⅰ型膠原。4℃濕盒過夜，37℃復(fù)溫1h，PBS振洗3次，5min/次。滴加1∶50稀釋的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS振洗3次，5min/次，DAB顯色，蘇木素胞核襯染，脫水封片。陰性對照用PBS代替一抗染色，其余步驟不變。

1.2.5圖像分析：利用HPIAS-1000彩色圖像分析系統(tǒng)對染色標(biāo)本進(jìn)行圖像分析，每張標(biāo)本選取5個高倍視野（40×10倍），每個視野選取四個區(qū)域測定細(xì)胞染色灰度值?；叶戎翟叫?，表明其染色程度越深。本實(shí)驗(yàn)所列結(jié)果為同代細(xì)胞、同批次染色的結(jié)果。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：將測得的灰度值利用SPSS 16進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，并進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)及來源圖

組織塊法培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞呈長梭型，少量多角型細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后生長較快，另有上皮細(xì)胞散在組織塊中央，多次差別消化法傳代，上皮細(xì)胞明顯減少，大部分細(xì)胞在為長梭型和多角型細(xì)胞（圖1）。免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞STRO-1陽性著色（圖2）。

圖1　原代細(xì)胞GMSCs（×40）

圖2　表達(dá)STRO-1（×40）

表1　不同濃度EMP對GMSCs的增殖作用

2.2不同濃度的EMPs對rMSCs生長的影響（A490值，x±s）

EMPs在50～200mg/L表現(xiàn)出促hGMSCs增殖的作用，50 mg/L EMPs即可以顯著促進(jìn)hGMSCs的生長，但以100 mg/L EMPs的促增殖作用最強(qiáng)（表1）。

2.3Ⅰ型膠原圖像分析及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

不同濃度EMP作用GMSCs 1周時，與第1天相比，Ⅰ型膠原表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

3　討論

間充質(zhì)干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞一樣遍布生物體的每個器官，近年來研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞是一個具有多種功能的細(xì)胞，它與慢性炎癥、腫瘤發(fā)生，腫瘤包裹及損傷修復(fù)相關(guān)，與間充質(zhì)干細(xì)胞具有許多相同的特點(diǎn)，如共同表達(dá)CD73，CD105，SSEA-1，SSEA-4不表達(dá)CD14，CD34 and CD45，可向骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化。牙齦是牙周組織的門戶，長期暴露在口腔中，不斷受到炎癥的侵襲和各種刺激，推測牙齦成纖維細(xì)胞在抵抗牙周疾病和牙周組織再生修復(fù)中具有一定的功能。EMPs的牙周再生作用已經(jīng)得到臨床和基礎(chǔ)研究的肯定。研究認(rèn)為EMPs對牙周膜細(xì)胞、牙囊細(xì)胞，骨髓細(xì)胞的生物學(xué)功能具有重要作用，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖及蛋白合成，自分泌一些生長因子而且可以促進(jìn)細(xì)胞向成骨方向分化［6-9］，促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原合成［10］，但是有關(guān)EMPs對牙齦及其細(xì)胞成分的生物學(xué)作用研究較少。鑒于此，課題組分離牙齦成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞特性，并用EMPs培養(yǎng)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)和圖像分析方法觀察EMPs對hGMSCs增殖和合成Ⅰ型膠原的影響，以期初步了解EMPs對hGMSCs的生物學(xué)作用。

實(shí)驗(yàn)用組織塊法分離培養(yǎng)了牙齦成纖維細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)STRO-1，證實(shí)牙齦成纖維細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性。STRO-1是間充質(zhì)干細(xì)胞最重要的早期標(biāo)志之一［11］，是骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離標(biāo)志，STRO-1陽性細(xì)胞具有向成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成骨成軟骨等間充質(zhì)來源細(xì)胞分化的特性［12］，血管內(nèi)皮細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞及牙周膜干細(xì)胞均表達(dá)STRO-1，具有多向分化特性［13-14］。

表2　hGMSCs在各濃度組、不同時間點(diǎn)的Ⅰ型膠原染色的灰度值

實(shí)驗(yàn)還觀察了EMPs對hGMSCs增殖和合成膠原的影響。即從濃度上看，EMPs在50-200mg/L表現(xiàn)出促hGMSCs增殖的作用，50 mg/L的EMPs即可以顯著促進(jìn)hGMSCs的生長，但以100mg/L的EMPs促增殖作用最強(qiáng)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，EMPs可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的hGMSCs合成Ⅰ型膠原。Ⅰ型膠原是重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，可促進(jìn)不同類型細(xì)胞生長，Ⅰ型膠原是結(jié)締組織的主要膠原蛋白成分，是牙齒硬組織、骨和軟骨的主要膠原類型，Ⅰ型膠原的表達(dá)與成骨活動關(guān)系密切，其mRNA的出現(xiàn)早于堿性磷酸酶和骨鈣素，是成骨細(xì)胞早期分化的特異性分子標(biāo)記，可以調(diào)節(jié)骨鈣素基因表達(dá)，是成骨標(biāo)志性產(chǎn)物，Ⅰ型膠原也是牙周膜的主要膠原成分，在牙周膜細(xì)胞向成骨方向分化時，Ⅰ型膠原明顯增強(qiáng)。先前的研究表明牙齦成纖維細(xì)胞在礦化誘導(dǎo)條件下也可形成礦化結(jié)節(jié)，但較成骨細(xì)胞牙周膜細(xì)胞量少，時間長，這可能與其含有的間充質(zhì)干細(xì)胞較少有關(guān)。成纖維細(xì)胞具有分泌多種細(xì)胞因子，維持間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境的功能［15-16］，這表明間充質(zhì)干細(xì)胞與成纖維細(xì)胞相伴存在。成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞在生物學(xué)特性上及其相似，具有許多共同特性，另外，間充質(zhì)干細(xì)胞依賴成纖維細(xì)胞來維持微環(huán)境的穩(wěn)定，根據(jù)需要與上皮細(xì)胞相互作用進(jìn)行發(fā)育、分化、組織修復(fù)和器官形成等生命活動。

其他部位的成纖維細(xì)胞也參與創(chuàng)傷修復(fù)，并能在誘導(dǎo)條件下向成骨方向分化，推測成纖維細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞具有相同特性，目前，只有從基因型分析間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，從生物學(xué)特性無法區(qū)分兩種細(xì)胞。創(chuàng)傷修復(fù)是多種細(xì)胞、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜動態(tài)過程。在各種創(chuàng)傷的修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞均起著極其重要的作用。骨折作為機(jī)體的一種創(chuàng)傷，它的修復(fù)過程即骨折的愈合過程及其復(fù)雜，除成骨細(xì)胞在骨折愈合過程中發(fā)揮決定作用外，成纖維細(xì)胞起著重要的作用.并參與了成骨過程，饒寒敏等［17］的實(shí)驗(yàn)證明，皮膚成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中可形成骨，并且其成骨過程中基質(zhì)合成、分泌和鈣鹽沉積的程序與成骨細(xì)胞成骨基本一致，符合骨組織形成的生理過程。這些研究均表明成纖維細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞具有極其相似的作用，成纖維細(xì)胞提供適宜的微環(huán)境，支持干細(xì)胞維持穩(wěn)定和向不同方向分化的作用［16］。

細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞微環(huán)境傳遞促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的信號分子，EMPs是Hertwig上皮根鞘分泌的釉質(zhì)發(fā)育過程中未礦化釉質(zhì)中含有的蛋白成分，研究表明EMPs可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞向牙骨質(zhì)和骨細(xì)胞分化，可影響多種細(xì)胞的基因表達(dá)、蛋白合成、增殖和分化過程，對牙齦成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞核牙囊細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和抑制分化的作用。有報道稱EMPs具有促進(jìn)成纖維樣細(xì)胞增殖而抑制上皮類細(xì)胞的作用，在牙周發(fā)育期調(diào)控細(xì)胞的行為，控制上皮間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用。近年來認(rèn)為EMPs還具有促進(jìn)皮膚等其他部位成纖維細(xì)胞的組織和膠原分泌作用。Vowden等［18］研究證實(shí)成釉蛋白可促進(jìn)較大面積難愈性潰瘍的愈合。在創(chuàng)面愈合過程中，成纖維細(xì)胞大量增殖，并分泌膠原和基質(zhì)成分，與新生毛細(xì)血管等共同形成肉芽組織，填補(bǔ)組織缺損，為表皮細(xì)胞的覆蓋創(chuàng)造條件。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)EMPs可促進(jìn)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和膠原分泌，一周觀察期內(nèi)可隨時間增殖作用增強(qiáng)。這為牙齦間充質(zhì)細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，目前牙種植技術(shù)為患者帶來了福音，但許多患者的軟組織嚴(yán)重缺失，限制了種植的適應(yīng)癥，利用EMPs和GMSCs的特性形成組織工程牙齦，可提高種植的成功率和使用范圍。

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Effection of enamel matrix proteins on proliferation and Type I collagen synthesis of human gingival mesenchymal stem cells

CHANG Xiu-Mei，ZHANG Ke-Rong，CAI Jie-Chen，QI Xiang-wei，WANG Shu-wen
（Second Clinical Medical College，Guangdong Medical College，Dongguan 523808，Guangdong，China）

ObjectiveTo assess the effects of enamel matrix proteins on proliferation and type I collagen synthesis of human gingival mesenchymal stem cells（hGMSCs）.Methods The primary gingival fibroblasts were cultured and then mesenchymal stem cell surface markers STRO-1 were characterized by Immunocytochemistry.hGMSCs was cultured in concentrations of enamel matrix protein 25 mg/L （A1 group），50 mg/L（A2 group），100 mg/L（A3 group），200 mg/L（groupA4），control group（group A0）DMEM solution of 2%FCS training，The cell proliferation was detected by MTT.Immunocytochemistry and image analysis of type I collagen synthesis.Results 50-200mg/L showed hGMSCs proliferation promoting effect，50 mg/L EMPs that can significantly promote the growth of hGMSCs，but to promote proliferation of the strongest 100 mg/L EMPs.（Compared with other groups，P＜0.01）in experimental group was better than control group，collagen synthesis.Among them，the most obvious 100mg/L promote the synthesis of collagen type I，and changing with time.Conclusion The enamel matrix protein can promote the proliferation of hGMSCs and type I collagen synthesis.

gingival mesenchymal stem cells；enamel matrix proteins；Type I collagen；proliferation

Q813.1

A

1008-6455（2015）08-0030-04

東莞市高等院?？蒲袡C(jī)構(gòu)科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2011108102028）；湛江市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2012C3103032）