閆明珠，鐘　雨，劉新民，張澤生，葉林虎，曹方瑞，肖冰心，馮　利，?！＄?*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所，北京100193）

荷葉提取物的鎮(zhèn)靜催眠作用

閆明珠1,2，鐘雨1,2，劉新民2，張澤生1，葉林虎2，曹方瑞2，肖冰心2，馮利2，常琪2,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所，北京100193）

目的：研究荷葉提取物（乙醇提取物、生物堿、總黃酮和小分子水溶物）對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用，篩選其活性組分。方法：利用空場實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實(shí)驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)，給予小鼠灌胃荷葉50%乙醇提取物（150、450 mg/kg）和不同分離組分（30、90 mg/kg）后，觀察其對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用。結(jié)果：高劑量荷葉乙醇提取物和低、高劑量荷葉生物堿均能顯著抑制小鼠的自主活動，增加閾下劑量戊巴比妥鈉引起的小鼠入睡率，縮短戊巴比妥鈉閾上劑量的小鼠入睡潛伏期，延長睡眠時間。結(jié)論：荷葉乙醇提取物具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用，生物堿是其主要活性成分。

荷葉；鎮(zhèn)靜；催眠；生物堿

荷葉為睡蓮科多年生水生草本植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的葉片。在2002年3月中國衛(wèi)生部衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]第51號文件中，荷葉被列入“既是食品又是藥品”的名單中[1]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為荷葉性苦性平，具有清暑利濕、升發(fā)清陽、清心去熱、止血利水的功效[2]?，F(xiàn)代研究表明荷葉具有降脂減肥、抑菌抗病毒、抗炎抗過敏、抗氧化、防衰老等多種生理活性[3]。荷葉中含有生物堿、黃酮、揮發(fā)油、鞣質(zhì)等多種次生代謝產(chǎn)物，其中生物堿和黃酮兩類化合物是荷葉中最重要的生物活性和生理功能成分[3]。

黃酮類化合物是荷葉活性物質(zhì)中含量比較多的一類成分，主要以苷類形式存在，苷元多為槲皮素、山奈酚和楊梅素[4]。荷葉中生物堿類化合物種類繁多，根據(jù)母核結(jié)構(gòu)的不同可將其分為3 類：阿樸啡類（荷葉堿、N-去甲荷葉堿、2-羥基-1-甲氧基阿樸啡等）[5-6]、單芐基異喹啉類[7]和去氫阿樸啡類[8]。

本研究利用陽離子交換樹脂柱和大孔吸附樹脂柱將荷葉乙醇提取物中的生物堿、總黃酮和小分子水溶物3 種組分分離[9-13]，采用空場實(shí)驗(yàn)[14]、戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實(shí)驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)[15]比較醇提物和各組分的鎮(zhèn)靜催眠活性，從而初步明確其活性組分，為進(jìn)一步探討荷葉鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

雄性健康ICR小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～20 g，由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2012-0001。動物飼養(yǎng)在恒溫（25±2）℃、恒濕（70%）、12 h明暗交替的SPF級動物房中，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔飲用水。實(shí)驗(yàn)前，動物分籠飼養(yǎng)，至少適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境48 h。所有動物均使用一次。

1.2材料與試劑

荷葉：2012年6月采自湖南，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所張本剛教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的葉。

地西泮（diazepam，DZP） 中國食品藥品檢定研究院；戊巴比妥鈉 美國Sigma公司；氯化鈉注射液四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；動物空場實(shí)驗(yàn)計(jì)算機(jī)在線檢測系統(tǒng)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所和中國航天員中心聯(lián)合研制。

1.4方法

1.4.1荷葉提取物的制備

干燥荷葉300 g剪碎成直徑大約為3 cm的碎片，加入9 L的50%乙醇室溫浸泡提取3 次，每次24 h。浸泡期間不時攪拌。提取液過濾后合并，于65 ℃減壓濃縮至無醇味。將所得濃縮液加入5 倍量的0.1% HCl，攪拌溶解后過濾，濾液經(jīng)D001陽離子交換樹脂柱（200 g）分離，先用不少于1倍樹脂量的純水洗去非生物堿部分后，再以含1%氨的95%乙醇溶液洗脫，將堿性醇洗脫液濃縮蒸干，得生物堿粉末[16]。D001樹脂柱的上樣流出液和水洗液合并后上樣至AB-8大孔吸附樹脂柱（300 g），水洗至中性后用70%乙醇洗脫，將乙醇洗脫液濃縮蒸干，得總黃酮粉末[17]。AB-8大孔樹脂柱的上樣流出液和水洗液濃縮后蒸干，得小分子水溶物部分。各提取物稱質(zhì)量，計(jì)算得率。生物堿組分和總黃酮組分分別采用碘化鉍鉀和三氯化鐵試劑進(jìn)行顯色定性鑒別[18]。所有提取物均放置于干燥器中保存。

取適量荷葉乙醇提取物2 份，分別加入0.5%的羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）溶液配成質(zhì)量濃度分別為15、45 mg/mL的溶液；荷葉總黃酮、荷葉生物堿和荷葉小分子水溶物均使用0.5%的CMC-Na溶液配制成質(zhì)量濃度分別為3、9 mg/mL的溶液，以用于不同劑量組的動物實(shí)驗(yàn)。

1.4.2荷葉提取物對小鼠自主活動的影響

120 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)48 h后，隨機(jī)分為10 組，每組12 只，分別為空白對照組（0.5% CMC-Na溶液），荷葉乙醇提取物低、高劑量組（150、450 mg/kg），荷葉總黃酮組、荷葉生物堿組及荷葉小分子水溶物的低、高劑量組（30、90 mg/kg）和DZP陽性對照組（5 mg/kg）。小鼠按0.01 mL/g灌胃給藥一次，于給藥后30 min，將小鼠放入圓形自主活動測試儀（直徑30 cm，高40 cm）中適應(yīng)環(huán)境5 min，然后開始記錄其在10 min內(nèi)的活動總路程、運(yùn)動路程、運(yùn)動時間、平均速率等指標(biāo)。

1.4.3荷葉提取物對戊巴比妥鈉催眠作用的影響

1.4.3.1戊巴比妥鈉催眠閾劑量的選擇[19]

小鼠64 只，隨機(jī)分為8 組，每組8 只。分別腹腔注射不同劑量的戊巴比妥鈉（20、25、30、35、40、45、50、55 mg/kg），注射體積為0.01 mL/g（下同），以給藥后小鼠翻正反射消失達(dá)30 s以上為入睡判斷標(biāo)準(zhǔn)（下同），觀察30 min內(nèi)小鼠入睡只數(shù)。戊巴比妥鈉的閾下催眠劑量是指90%以上小鼠不入睡的最大劑量，而閾上催眠劑量則是指100%小鼠全部入睡的最小劑量。

1.4.3.2對戊巴比妥鈉所致的入睡率的影響

小鼠120 只，隨機(jī)分為10 組，每組12 只，分別為空白對照組（0.5% CMC-Na）、DZP陽性對照組（2 mg/kg）、荷葉乙醇提取物低、高劑量組（150、450 mg/kg）和荷葉總黃酮、荷葉生物堿及荷葉小分子水溶物的低、高劑量組（30、90 mg/kg）。小鼠按0.2 mL/20 g灌胃給藥一次，于給藥后30 min腹腔注射戊巴比妥鈉催眠閾下劑量25 mg/kg。記錄注射后30 min內(nèi)小鼠入睡只數(shù)。

1.4.3.3對戊巴比妥鈉所致的入睡潛伏期和睡眠時間的影響

小鼠120 只，按1.4.2節(jié)方法分組和給藥，各組動物給藥后30 min，腹腔注射戊巴比妥鈉睡眠閾上劑量50 mg/kg，記錄注射戊巴比妥鈉后小鼠入睡和覺醒（翻正反射恢復(fù)）的時間。從注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失的時間為入睡潛伏期，從入睡到覺醒的時間為睡眠時間。

1.5數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果與分析

2.1荷葉提取物的制備

本實(shí)驗(yàn)成功利用D001型陽離子交換樹脂將荷葉中的生物堿富集，而與黃酮類化合物分離，然后用AB-8性大孔樹脂將黃酮類化合物富集，與小分子水溶性成分如氨基酸、維生素、鹽類等分離開來。所得生物堿部分與碘化鉍鉀試劑反應(yīng)呈陽性，與三氯化鐵試劑反應(yīng)呈陰性；而黃酮部分則相反，與碘化鉍鉀試劑呈陰性反應(yīng)，與三氯化鐵試劑呈陽性反應(yīng)，小分子水溶性物部分既無生物堿反應(yīng)，也無黃酮反應(yīng)。說明荷葉中的生物堿和黃酮通過兩種樹脂柱可以得到很好的富集和分離，并均與小分子水溶性成分分離。3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值顯示，荷葉乙醇提取物、總黃酮、生物堿和小分子水溶物的得率分別為24.86%、3.05%、1.34%和21.42%（以干荷葉計(jì)）。

2.2荷葉提取物對小鼠自主活動的影響

圖1　荷葉提取物對小鼠自主活動的影響（n=12）=12Fig.1Effect of Nelumbo nucifera leaf extracts on locomotion activity in mice（n =12）

如圖1所示，荷葉乙醇提取物、荷葉總黃酮、荷葉生物堿和小分子水溶物均能不同程度地降低小鼠的自主活動，且隨著劑量的增加，活動減少的程度增大。但是，只有荷葉乙醇提取物組（450 mg/kg）和荷葉生物堿組（90 mg/kg）能顯著降低小鼠的總路程、運(yùn)動時間和平均速率（P＜0.05或P＜0.001）。與空白對照組相比，荷葉乙醇提取物組（450 mg/kg）小鼠的總路程、運(yùn)動路程、運(yùn)動時間和平均速率降低了21.15%、26.10%、25.49%和21.49%；荷葉生物堿組（90 mg/kg）分別降低了39.50%、73.41%、69.91%和39.46%。

2.3荷葉提取物對戊巴比妥鈉催眠作用的影響

2.3.1戊巴比妥鈉催眠閾劑量的選擇

腹腔注射戊巴比妥鈉劑量為20、25 mg/kg時，在30 min內(nèi)沒有小鼠入睡；當(dāng)注射劑量增加為30、35、40、45、50、55 mg/kg時，小鼠的入睡率分別為25%、38%、75%、88%、100%、100%。因此，ICR小鼠的戊巴比妥鈉的閾下睡眠劑量定為25 mg/kg，而ICR小鼠的戊巴比妥鈉閾上催眠劑量選擇50 mg/kg。

2.3.2荷葉提取物對戊巴比妥鈉所致入睡率的影響

表1　荷葉提取物對戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率的影響（n==1122）Table1Effectt ooff Nelumbo nucifeerraa leaf extracts on the sleeping ratee ooff mice induced by sodium pentobarbittaall（n==1122）

注：**.與空白對照組相比，P＜0.01；***.與空白對照組相比，P＜0.001。下同。

荷葉各提取物組對戊巴比妥鈉閾下劑量（25 mg/kg）下小鼠入睡率的影響如表1所示，DZP陽性對照組顯示出很強(qiáng)的催眠作用，給藥劑量為2 mg/kg即可使戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠入睡率達(dá)100%。荷葉提取物各組和空白對照組相比，小鼠的入睡率均有不同程度增加，且有一定的量效關(guān)系。但是只有荷葉乙醇提取物組（450 mg/kg）和荷葉生物堿組（30、90 mg/kg）能顯著增加小鼠的入睡率（P＜0.01或P＜0.001）。與空白對照組的0%相比，荷葉乙醇提取物組（450 mg/kg）和荷葉生物堿組（30、90 mg/kg）的小鼠入睡率分別增加至58%、75%和100%。尤其是荷葉生物堿組（90 mg/kg）的小鼠入睡率能達(dá)到100%，和DZP陽性對照組相同。

2.3.3荷葉提取物對戊巴比妥鈉所致的入睡潛伏期和睡眠時間的影響

表2荷葉提取物對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響（Table2Efecs of Nelumbo nuciffeerraa leaf extracts on sleep latency and sleep duration of mice induced by sodium pentobarbita

表2荷葉提取物對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響（Table2Efecs of Nelumbo nuciffeerraa leaf extracts on sleep latency and sleep duration of mice induced by sodium pentobarbita

注：*.與空白對照組相比，P＜0.05。

組別劑量/（mg/kg）入睡潛伏期/min睡眠時間/min空白對照組04.28±0.3341.44±4.11荷葉乙醇提取物組1503.67±0.2057.54±6.26 4503.05±0.1665.35±3.97*荷葉總黃酮組303.74±0.2252.95±3.61 904.56±0.7753.89±7.84荷葉生物堿組303.05±0.2565.03±3.19* 902.70±0.10*160.80±9.42***荷葉小分子水溶物組304.62±0.2055.24±6.07 904.93±0.3258.90±3.34 DZP陽性對照組22.60±0.12*142.90±8.82***

如表2所示，與空白對照組相比，荷葉生物堿組（90 mg/kg）和DZP陽性對照組小鼠的入睡潛伏期均顯著縮短，分別縮短了36.85%、39.26%（P＜0.05）。同時荷葉提取物各組均能不同程度地延長小鼠的睡眠時間，但是只有荷葉乙醇提取物組（450 mg/kg）、荷葉生物堿組（30、90 mg/kg）和DZP陽性對照組能顯著延長小鼠睡眠時間（P＜0.05或P＜0.001）。

3　討論

空場實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實(shí)驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時間實(shí)驗(yàn)均顯示荷葉各提取物能不同程度地抑制小鼠的自主活動，提高小鼠入睡率，縮短入睡潛伏期，延長睡眠時間，具有鎮(zhèn)靜催眠的活性。荷葉化學(xué)成分的研究表明荷葉黃酮中主要含有槲皮素糖苷類化合物[16]，荷葉生物堿中主要含有2-羥基-1-甲氧基阿樸啡、N-去甲荷葉堿和荷葉堿等阿樸啡類生物堿[17]。有研究顯示槲皮素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮的神經(jīng)活性[20-21]，荷葉中的荷葉堿能誘導(dǎo)僵直癥，抑制自發(fā)性運(yùn)動、條件躲避反應(yīng)等，具有中樞神經(jīng)抑制活性[22-24]。由此可見，荷葉中的黃酮和生物堿為其鎮(zhèn)靜催眠活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。水溶物中主要含有小分子的氨基酸和糖類，在減壓濃縮的過程中，不斷升高的pH值和較高的溫度為美拉德反應(yīng)提供了合適的條件，生成還原酮等活性物質(zhì)[25]，推測這些活性物質(zhì)使得濃縮的小分子水溶物也具有微弱的鎮(zhèn)靜催眠神經(jīng)活性。但是，與空白對照組相比，只有荷葉乙醇提取物和荷葉生物堿部分具有顯著的鎮(zhèn)靜催眠作用。

綜上所述，荷葉乙醇提取物具有鎮(zhèn)靜催眠的活性，生物堿類成分是其活性成分。本實(shí)驗(yàn)為荷葉在鎮(zhèn)靜催眠方面的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，但是其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Sedative and Hypnotic Effects of the Extracts from Nelumbo nucifera Leaves

YAN Mingzhu1,2, ZHONG Yu1,2, LIU Xinmin2, ZHANG Zesheng1, YE Linhu2, CAO Fangrui2, XIAO Bingxin2, FENG Li2, CHANG Qi2,*
(1.School of Food Engineering and Biological Technology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

Objective: The present study aimed to determine the sedative and hypnotic effects of 50% ethanol extract and its different fractions prepared from Nelumbo nucifera leaves. Methods: Locomotion activity and pentobarbital-induced sleeping tests were used to evaluate the sedative and hypnotic activities of 50% ethanol extract (150 and 450 mg/kg) and different fractions (30 and 90 mg/kg) through gavage administration. Results: Ethanol extract (450 mg/kg) and alkaloid fraction (30 and 90 mg/kg) signifi cantly inhibited the locomotion activity of mice, increased the percentage of sleeping and decreased the sleep latency and prolonged the sleeping time of mice. Conclusion: Nelumbo nucifera leaves possess sedative and hypnotic effects and its alkaloids are the bioactive components for these activities.

Nelumbo nucifera leaves; sedative; hypnotic; alkaloids

R285.5

A

1002-6630（2015）05-0168-04

10.7506/spkx1002-6630-201505032

2014-04-28

科技部對歐盟科技合作專項(xiàng)（1108）；科技部國際科技合作項(xiàng)目（2011DFA32730）

閆明珠（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楸＝∈称饭δ茉u價。E-mail：yanmingzhu906@126.com

常琪（1962—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幬锎x動力學(xué)。E-mail：qchang@implad.ac.cn