張杰，張永勤*，羅彩華，劉征東，程袁芬，盧菲菲，張童

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

海參體壁中α-1，4淀粉酶的分離純化及性質(zhì)

張杰，張永勤*，羅彩華，劉征東，程袁芬，盧菲菲，張童

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

通過(guò)采用勻漿、硫酸銨鹽析、透析、DEAE-52陰離子交換層析、Sephacryl S-300凝膠層析等方法從海參體壁中分離純化并得到了α-1，4淀粉酶。結(jié)果表明，該酶具有3條亞基鏈，分子質(zhì)量約為420kD；最適pH值為9.0，最適溫度為80℃，90℃條件下保溫30min后仍有38%以上的相對(duì)酶活性，因此，該酶是一種具有較高熱穩(wěn)定性的堿性高溫淀粉酶。K+、Fe3+和Mn2+對(duì)其有較強(qiáng)的抑制作用，Cu2+和Ca2+對(duì)其有較強(qiáng)的激活作用。

海參；自溶；淀粉酶；分離；純化；熱穩(wěn)定性

α-1，4淀粉酶（1，4-α-D-葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1）是以淀粉為底物，從淀粉糖鏈內(nèi)部水解1，4-α-D-葡萄糖苷鍵的一類(lèi)酶。該酶廣泛存在于微生物［1-2］、植物［3］及動(dòng)物的消化體系［4-6］中。

海參是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)品，隨著消費(fèi)者對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的逐步認(rèn)識(shí)以及產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的日益擴(kuò)大，70多個(gè)國(guó)家投入到海參產(chǎn)業(yè)［7］。迄今為止海參產(chǎn)品主要仍是以干制海參為主，即食產(chǎn)品的保藏問(wèn)題始終是困擾業(yè)界的技術(shù)難題。因海參在貯存及加工過(guò)程中，會(huì)發(fā)生自溶現(xiàn)象［8］，甚至在經(jīng)過(guò)高溫?zé)崃μ幚碇笕噪y避免。所以，對(duì)海參體壁熱穩(wěn)定性酶的探尋及其與自溶相關(guān)性的研究一直是近幾年來(lái)的熱點(diǎn)問(wèn)題。

目前所發(fā)現(xiàn)并研究的與海參相關(guān)的酶大部分集中在海參內(nèi)臟，特別是消化道［9-12］中，而針對(duì)海參體壁的酶系研究較少，僅報(bào)道了海參體內(nèi)幾種蛋白酶［13-14］及酸性磷酸酶［15］等，關(guān)于海參體壁中α-1，4淀粉酶的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)分離純化了海參體壁中的α-1，4淀粉酶，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了探討，以期對(duì)海參生理生化特性研究以及防止海參自溶提供相關(guān)理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

海參青島臺(tái)東水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)。

可溶性淀粉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate，MBTH）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）美國(guó)Sigma公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker日本TaKaRa公司。

1.2儀器與設(shè)備

SHZ-82恒溫水浴振蕩器國(guó)華電器有限公司；UNICO-2100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；層析設(shè)備上海滬西分析儀器廠有限公司；電泳儀北京六一儀器廠；pH計(jì)梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；移液槍賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1粗酶液制備

取新鮮海參，除內(nèi)臟，將體壁用蒸餾水清洗，按照質(zhì)量體積比1∶3（m/V）與醋酸-醋酸鈉緩沖液（0.05mol/L，pH5.0）混合并勻漿后，靜置過(guò)夜，6640×g離心15min，取上清液加入硫酸銨至80%飽和度，靜置4h，離心后將沉淀溶于0.02mol/L，NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH7.4），并用該緩沖液透析后即得粗酶液。以上操作均在4℃條件下完成。

1.3.2酶活力測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)［16］的方法，稍加修改。具體操作如下：取0.25mL酶液與0.25mL底物（質(zhì)量濃度為1mg/mL淀粉溶液）預(yù)熱后混合，在設(shè)定溫度條件下酶解一段時(shí)間后，加入0.5mL0.5mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，再加入0.5mL MBTH試劑（3mg/mL MBTH溶液和1mg/mL DTT溶液等量混合，現(xiàn)用現(xiàn)配），充分混合，于80℃條件下水浴加熱15min后，立即加入1mL硫酸鐵銨試劑（0.5g/100mL FeNH4（SO4）2·12H2O、0.5g/100mL氨基磺酸、0.5mol/L鹽酸），室溫下放置1h，然后于630nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照組為0.25mL酶液與0.25mL底物溶液分別加熱，與反應(yīng)組加熱相同時(shí)間后，按照酶、NaOH、底物的順序與0.5mL0.5mol/L NaOH溶液混合，測(cè)定同上。每組作3個(gè)平行樣。

酶活力單位（U）定義：在上述反應(yīng)條件下，以每分鐘水解底物釋放出相當(dāng)于1μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Lowry法［17］，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)的含量。層析時(shí)所測(cè)蛋白質(zhì)含量采用紫外分光光度法［18］。

1.3.4海參體壁中α-1，4淀粉酶的純化

用0.02mol/L，NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH7.4）平衡DEAE-52柱（Φ2.0cm×15cm），取粗酶液上樣，用分別含0.3、0.4、0.6、2mol/L NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行階段式洗脫。洗脫流速為1.5mL/min，用自動(dòng)部分收集器收集，每管6mL，于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線，將活性高的樣品合并，用聚乙二醇-20000濃縮，得樣品A；用0.02mol/L，NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH7.4）平衡Sephacryl S-300HR柱（Φ1.0cm×76cm），將A樣品上柱，洗脫流速為0.25mL/min，分步收集，每管2mL，于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制洗脫曲線，將活性部分收集，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1pH值對(duì)酶活力的影響

分別用0.2mol/L不同pH值的緩沖溶液來(lái)配制1mg/mL淀粉溶液。其中，pH3.0～8.0的緩沖溶液用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系，pH8.5～10.0用Gly-NaOH緩沖體系。取0.25mL經(jīng)純化后的酶液與0.25mL按上述條件配制的淀粉溶液充分混合，按照1.3.2節(jié)測(cè)定酶活力，其中溫度為50℃，時(shí)間為1h。

1.4.2溫度對(duì)酶活力的影響

取0.25mL經(jīng)純化后的酶液與0.25mL1mg/mL淀粉溶液（用0.2mol/L，pH9.0Gly-NaOH緩沖溶液配制）充分混合，按照1.3.2節(jié)測(cè)定酶活力。其中溫度分別為30、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90℃，時(shí)間為30min。

1.4.3熱穩(wěn)定性測(cè)定

用0.2mol/L，pH9.0Gly-NaOH緩沖溶液配制1mg/mL淀粉溶液，將純酶液分別在30、40、50、60、70、80、90℃條件下加熱30min以后，取出并放在冰浴中迅速冷卻。取0.25mL經(jīng)加熱后的純酶液與0.25mL底物溶液充分混合，按照1.3.2節(jié)測(cè)定酶活力，其中溫度為50℃，時(shí)間為1h。

1.4.4金屬離子對(duì)酶活力的影響

用0.2mol/L、pH9.0Gly-NaOH緩沖溶液配制1mg/mL淀粉溶液，分別加入終濃度為10mmol/L的CaCl2、MgCl2、KCl、FeCl3、BaCl2、CaCl2、ZnCl2、CuSO4、MgCl2和MnCl2，終濃度為5mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）。取0.25mL經(jīng)純化的酶液與0.25mL底物溶液充分混合，按照1.3.2節(jié)測(cè)定酶活力，其中溫度為50℃，時(shí)間為1h。

1.5酶的分子質(zhì)量測(cè)定

根據(jù)Laemmli的方法［19］，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳中使用6%的分離膠，3%的濃縮膠，90V恒壓電泳。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的范圍為44.3～200kD。樣品的分子質(zhì)量可以根據(jù)公式來(lái)計(jì)算。

式中：Mr為分子質(zhì)量/kD；K和K1為常數(shù)；Rf是相對(duì)遷移率。

2　結(jié)果與分析

2.1海參體壁中α-1，4淀粉酶的分離純化

DEAE-52陰離子交換層析結(jié)果見(jiàn)圖1，用分別含0.3、0.4、0.6、2mol/L NaCl的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液進(jìn)行洗脫。發(fā)現(xiàn)4個(gè)蛋白質(zhì)洗脫峰，其中峰1具有明顯的α-1，4淀粉酶活性，其余3個(gè)蛋白質(zhì)峰同樣具有α-1，4淀粉酶活性，但是總蛋白質(zhì)質(zhì)量不高。凝膠層析結(jié)果見(jiàn)圖2，將陰離子交換層析洗脫峰1收集，經(jīng)濃縮后，進(jìn)行Sephacryl S-300柱層析，得到3個(gè)蛋白質(zhì)峰，其中峰1具有明顯的α-1，4淀粉酶活性。收集此組分，做純度檢驗(yàn)和酶學(xué)性質(zhì)研究。整個(gè)純化過(guò)程及結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1　1α-1，4淀粉酶離子交換層析及其各組分的酶活力Fig.1Ion exchange chromatography and activity assay ofα-1，4-amylase

圖2Sephacryl S-300凝膠層析及其各組分的酶活力Fig.2Sephacryl S-300gel filtration chromatography and activity assay ofα-1，4-amylase

表1　1α-1，4淀粉酶純化過(guò)程及結(jié)果Table1Purification process of sofα-1，4-amylase

2.2pH值對(duì)α-1，4淀粉酶酶活力的影響

圖3pH值對(duì)pHα-1，4淀粉酶酶活力的影響Fig.3Effect of pH onα-1，4-amylase activity

由圖3可知，該淀粉酶在pH3.0～5.5之間，基本不顯示活力；在pH6.0～8.0之間，保持平穩(wěn)的較低酶活力；其最適pH值為9.0，在高于或者低于pH9.0時(shí)，該淀粉酶活力明顯下降。通過(guò)了解該淀粉酶的最適pH值，對(duì)于控制該酶活性具有一定的指導(dǎo)作用，進(jìn)而為海參自溶機(jī)理的研究提供了理論依據(jù)。

圖4溫度對(duì)α-1，4淀粉酶活性的影響Fig.4Effect of temperature onα-1，4-amylase activity

2.3溫度對(duì)α-1，4淀粉酶酶活力的影響由圖4可知，該淀粉酶的最適溫度為80℃，當(dāng)溫度低于80℃時(shí)，α-1，4淀粉酶活力隨著溫度的升高逐漸升高；當(dāng)溫度在80～90℃之間時(shí)，酶仍然保持一個(gè)較高的活力。由此，可認(rèn)為該淀粉酶屬于高溫淀粉酶。

2.4α-1，4淀粉酶的熱穩(wěn)定性

圖55α-1，4淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.5Thermal stability ofα-1，4-amylase

將該淀粉酶液分別在不同溫度下保溫30min后，在50℃和80℃條件下分別測(cè)酶活力，結(jié)果如圖5所示。在80℃條件下測(cè)定酶活力時(shí)，隨著保溫溫度的升高，酶活力下降比較迅速，在80～90℃時(shí)，相對(duì)酶活力比較穩(wěn)定，約為44%；在50℃條件下測(cè)定酶活力時(shí)，隨著保溫溫度的升高，酶活力下降平緩，當(dāng)達(dá)到90℃時(shí)，其相對(duì)酶活力為38%。在50℃和最適溫度80℃條件下測(cè)定α-1，4淀粉酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，其相對(duì)酶活力下降趨勢(shì)基本保持一致，說(shuō)明高溫條件下的酶解過(guò)程對(duì)酶的熱穩(wěn)定性影響不大。

朱蓓薇等［13-15］報(bào)道的海參體壁中發(fā)現(xiàn)的磷酸激酶、組織蛋白酶、類(lèi)半胱氨酸蛋白酶均具有一定的熱穩(wěn)定性，其中后者的熱穩(wěn)定性最高，80℃保溫后約有25%左右的殘留酶活性。而本實(shí)驗(yàn)所述的在海參體壁中發(fā)現(xiàn)的α-1，4淀粉酶在90℃加熱滅活30min后仍然有38%以上的相對(duì)酶活力，說(shuō)明該酶具有較高的熱穩(wěn)定性。

高溫處理海參體壁的原理之一在于高溫使酶蛋白變性而喪失催化活性，從而達(dá)到即食海參的保藏目的。然而，在90℃加熱30min以后，該淀粉酶仍然具有很高的殘留酶活力。這一較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性?xún)?nèi)源酶很可能是導(dǎo)致海參在加工過(guò)程中自溶的重要原因之一，但是若在海參加工過(guò)程中只是加大熱力程度達(dá)到滅酶的目的又會(huì)導(dǎo)致海參體壁過(guò)分失水而影響其商業(yè)價(jià)值，因此，有必要考察其他因子對(duì)該酶活力的影響。

2.5金屬離子對(duì)α-1，4淀粉酶酶活力的影響由表2可知，Ba2+、K+、Fe3+、Mn2+對(duì)該淀粉酶具有抑制作用，其中Mn2+抑制效果最強(qiáng)，能夠抑制60%的酶活性，與對(duì)照組相比Ba2+、K+、Fe3+組的相對(duì)酶活力分別為90%、65%和73%，在海參加工過(guò)程中適當(dāng)?shù)募尤胍恍?/p>

表2金屬離子對(duì)α-1，4淀粉酶酶活力的影響Table2Effects of metal ions on sonα-1，4-amylase activity vity

Mn2+、Fe3+可能有利于防止海參自溶。Mg2+、Ca2+和Cu2+

對(duì)該淀粉酶具有一定的激活作用，與對(duì)照組相比，其測(cè)得的相對(duì)酶活力分別為120%、164%和189%。而EDTA組與對(duì)照組相比，其相對(duì)酶活力為86%，因此可以初步判定該酶為一種金屬酶。

2.6SDS-PAGE電泳分析

圖6SDS-PAGE凝膠層析電泳結(jié)果Fig.6SDS-PAGE of the purifiedα-1，4-amylase

由圖6可知，通過(guò)樣品緩沖液中添加β-巰基乙醇和未添加β-巰基乙醇組的對(duì)照，推斷該α-1，4淀粉酶可能由3個(gè)亞基組成，亞基之間通過(guò)二硫鍵相連；而經(jīng)凝膠層析純化后酶的電泳結(jié)果為一個(gè)條帶，達(dá)到了電泳純。根據(jù)Laemmli的理論計(jì)算3條亞基分子質(zhì)量分別為99.3、122.5、198.2kD，因此，推定該淀粉酶分子質(zhì)量約為420kD。

大多數(shù)蛋白質(zhì)在50℃或更高溫度下，會(huì)發(fā)生變形而導(dǎo)致失活。但是蛋白質(zhì)中的肽鏈之間的結(jié)合因二硫鍵的存在而更加緊密，有研究認(rèn)為二硫鍵能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，對(duì)于蛋白質(zhì)（或酶）的熱穩(wěn)定性具有重要意義［20］。因?yàn)榧兓玫降牡矸勖甘且环N多亞基蛋白，亞基之間存在二硫鍵，因此，可以推斷該酶具有的良好熱穩(wěn)定性，這與分子中的二硫鍵有很大關(guān)系。

3　結(jié)論

將粗酶中的淀粉酶經(jīng)過(guò)DEAE-52陰離子交換層析和Sephacryl S-300凝膠層析后得到了純化了18.42倍的α-1，4淀粉酶，通過(guò)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)該酶具有3個(gè)亞基鏈，分子質(zhì)量分別為99.3、122.5kD和198.2kD。對(duì)該淀粉酶進(jìn)行部分特性研究發(fā)現(xiàn)，該酶的最適pH值為9.0，最適溫度為80℃，是一種高溫淀粉酶，并且具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。K+、Fe3+和Mn2+對(duì)酶活力有較強(qiáng)的抑制作用，而Cu2+和Ca2+對(duì)其有較強(qiáng)的激活作用。該酶具有高熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)與即食海參體壁自溶相關(guān)性的研究，尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Purification and Characterization ofα-1，4-Amylase in Body Wall of Sea Cucumber

ZHANG Jie，ZHANG Yongqin*，LUO Caihua，LIU Zhengdong，CHENG Yuanfen，LU Feifei，ZHANG Tong
（College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao266042，China）

α-1，4-Amylase was extracted and isolated from the body wall of sea cucumber by homogenization，salting out with ammonium sulfate，dialysis，DEAE-52anion exchange chromatography and Sephacryl S-300gel chromatography sequentially.The results showed that the purified enzyme had three subunit chains according to the SDS-PAGE，with molecular weight of420kD；the optimum pH and temperature were9.0and80℃；and the residual activity remained at least38%after inactivation at90℃for30min.Therefore，this enzyme is a thermostable alkaline amylase.This amylase could be strongly activated by K+，F(xiàn)e3+or Mn2+and inhibited by Cu2+or Ca2+.

sea cucum ber；autolysis；amylase；isolation；purification；thermostability

TS254.9

A

1002-6630（2015）05-0137-05

10.7506/spkx1002-6630-201505026

2014-03-14

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013CM027）

張杰（1987—），男，碩士，研究方向?yàn)槊腹こ?、生化分析。E-mail：piccolo-3127@163.com

張永勤（1965—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槊腹こ?、生化分析。E-mail：zyq0205@qust.edu.cn