孫 翔 羅龍華 馮 亮

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（江西南昌 330006）

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因-1在前列腺癌組織中的表達及其意義*

孫 翔 羅龍華 馮 亮

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（江西南昌 330006）

目的 分析腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因-1（TMSG-1）在前列腺癌細胞株中與前列腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法 PCR法檢測TMSG-1在人不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株低轉(zhuǎn)移潛能（PC-3M-284）和高轉(zhuǎn)移潛能（PC-3M-IE8）中的表達，Matrigel穿膜實驗檢測腫瘤細胞體外侵襲能力，采用免疫組織化學(xué)方法檢測TMSG-1在人前列腺增生及前列腺癌組織中的表達。結(jié)果 兩種不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株中TMSG-1 mRNA的相對表達量之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TMSG-1在低轉(zhuǎn)移潛能（PC-3M-2B4）細胞株的mRNA（2.8±0.3）明顯高于高轉(zhuǎn)移潛能細胞株P(guān)G-IE8的表達（1.2±0.2）。免疫組化檢測TMSG-1在前列腺增生陽性表達高于前列腺癌表達，差異顯著；Matrigel穿膜侵襲實驗結(jié)果顯示，3個正義轉(zhuǎn)染組的穿膜細胞明顯減少，穿膜細胞數(shù)分別為42.31±3.16、52.00±1.83和23.93±2.79，與空白對照組（82.01±3.14）和空載體對照組（78.00±3.02）相比，均明顯減少，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 TMSG-1具有抑制前列腺癌細胞生長、促進其凋亡、抑制其侵襲能力等重要功能，TMSG-1的表達與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移潛能呈負相關(guān)。

基因, 腫瘤抑制; 前列腺腫瘤；細胞系, 腫瘤; 腫瘤轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是近年研究的一大熱點，其表達高低與某些腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。從1988年發(fā)現(xiàn)首個腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因NM23至今[1]，共有數(shù)十個基因被研究并確定為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。其調(diào)節(jié)癌細胞的生長信號及腫瘤細胞的生物學(xué)行為、抑制腫瘤細胞的趨化性和侵襲性、限制腫瘤細胞遷徙的機制逐漸明確，在臨床實踐中的價值也越來越受到重視。前列腺癌是威脅老年男性的主要惡性腫瘤[2]。我國前列腺癌的發(fā)病率雖明顯低于歐美國家， 但隨著人均壽命延長、膳食結(jié)構(gòu)改變和診斷技術(shù)提高[3]， 發(fā)病率呈明顯升高趨勢， 在男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率躍居第3位。我們采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及細胞爬片免疫熒光組織化學(xué)方法，檢測人不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株中TMSG-1在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達差異，證實了TMSG-1在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用。我們采用免疫組化法檢測了50例前列腺癌標本中TMSG-1的表達，探討其在前列腺癌生長、發(fā)生轉(zhuǎn)移中的作用意義。

材料與方法

一、一般資料

人前列腺癌細胞株P(guān)C-3M-2B4和PC-3M-IE8由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系癌生物學(xué)研究室提供。TMSG-1全長真核表達載體pcDNA3.0.TMSG-1-FLAG由本室構(gòu)建并保存。Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品，G418、二苯基溴化四氮唑藍（MrIYI’）和小鼠抗FLAG標簽單克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品，小鼠抗人B-Tubulin單克隆抗體為Neomarker公司產(chǎn)品，低熔點瓊脂糖為Bethesda Research Laboratories公司產(chǎn)品，Matrigel為BD公司產(chǎn)品，碳酸酯微孔濾膜為Millipore公司產(chǎn)品。

二、方法

實時熒光定量PCR方法檢測不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株中mRNA的相對表達量：細胞總RNA提取嚴格按照Trizol總RNA抽提試劑盒說明書進行，所得RNA進行濃度、純度及完整性的檢測，按RT試劑說明進行RT反應(yīng)，實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 3 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30 s 共進行40個循環(huán)，GADPH作為內(nèi)參考。

（一）活細胞計數(shù)

取對數(shù)生長期的細胞，以每孔1.0×104個細胞的密度接種于24孔板，3個正義轉(zhuǎn)染組（IE8-S1、IE8-S2、IE8-S3）、空白對照組和空載體轉(zhuǎn)染組每組每天設(shè)3個平行孔。自次日起每組每天消化3個平行孔，進行活細胞計數(shù)，取平均值。連續(xù)檢測7 d，繪制細胞生長曲線。

（二）采用免疫組化法檢測前列腺癌組織中TMSG-1的表達

嚴格按照PV-9000免疫組織化學(xué)試劑盒來檢測40例前列腺增生組織及60例前列腺癌組織中TMSG-1的表達，判定標準為：光鏡下以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，由兩名病理醫(yī)師分別在高倍鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)。結(jié)合陽性細胞染色強弱及陽性細胞百分比兩個方面計算TMSG-1的免疫組織化學(xué)染色評分。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS15.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析，當 P＜0.05 時為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、實時熒光定量PCR方法檢測不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株中mRNA的相對表達量

提取的RNA無降解。TMSG-1主要定位于胞質(zhì)中，靠近細胞膜處陽性信號普遍增強。兩種腫瘤細胞株內(nèi)都能檢測到TMSG-1蛋白，前列腺癌細胞株中TMSG-1實時熒光定量PCR產(chǎn)物約134bp。兩種不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株中TMSG-1 mRNA的相對表達量之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。TMSG-1在低轉(zhuǎn)移潛能（PC-3M-2B4）細胞株的mRNA（2.8±0.3）明顯高于高轉(zhuǎn)移潛能細胞株P(guān)G-IE8的表達（1.2±0.2），差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

二、RT-PCR檢測

結(jié)果顯示，所選取的3個正義轉(zhuǎn)染克?。≒C-3M-1E8 s1、s2、s3）均有TMSGl-FLAG融合基因的mRNA轉(zhuǎn)錄（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測結(jié)果

三、免疫組化檢測

免疫組化檢測TMSG-1在前列腺增生陽性表達高于前列腺癌表達，差異顯著，P＜0.05，TMSG-1在前列腺組織的表達見圖2A，TMSG-1在前列腺增生組織中的表達見圖2B。

四、TMSG-1表達上調(diào)對PC-3M-1 E8細胞體外侵襲能力的影響

Matrigel穿膜侵襲實驗結(jié)果顯示，3個正義轉(zhuǎn)染組的穿膜細胞明顯減少（圖3），穿膜細胞數(shù)分別為42.31±3.16、52.00±1.83和23.93±2.79，與空白對照組（82.01±3.14）和空載體對照組（78.00±3.02）相比，均明顯減少（P＜0.05），差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 TMSG-1在前列腺（A）及前列腺增生組織（B）中的表達（×200）

圖3 表示Matrigel穿膜侵襲試驗顯示3個正義轉(zhuǎn)染組的穿膜細胞明顯減少（HE染色×100）

討 論

前列腺癌在美國位于男性惡性腫瘤的發(fā)病率第1位，死亡率第2位[4]。近20年來，隨著我國人均壽命的延長、膳食結(jié)構(gòu)的改變和診斷技術(shù)的提高，前列腺癌的發(fā)病率明顯升高，在男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率躍居第3位[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最嚴重的后果，對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因尤其是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的研究，一直是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，并對其功能展開研究，如NM23、MKK4、KAll、BRMSl和KISSI等。TMSG-1又名LASS2（LAGI longevity assurance homolog 2），是一個編碼380個氨基酸的跨膜蛋白，含有10個外顯子，相對分子質(zhì)量為45000，定位于人染色體1q21.2上[6]。

蘇靜等[7]將TMSG-1真核表達載體轉(zhuǎn)染篩選出 3個TMSG-1高表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMSG-1的表達上調(diào)可降低前列腺癌細胞體外增殖能力。國外近年的研究表明[8]，包括TMSG-1在內(nèi)的LASS家族各成員，均可使細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平明顯升高。神經(jīng)酰胺是神經(jīng)鞘脂代謝中的重要脂質(zhì)分子，在對多種腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酰胺可抑制腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，具有腫瘤抑制作用[9]。通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測顯示，在低轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株P(guān)C-3M-2B4中的TMSG-1 mRNA表達量明顯高于在高轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株P(guān)C-3MIE8中的表達，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明TMSG-1基因參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移，并呈現(xiàn)明顯負相關(guān)。另外免疫熒光、定量比較分析兩種不同轉(zhuǎn)移潛能前列腺癌細胞株中TMSG-1的表達發(fā)現(xiàn)，TMSG-1主要定位于胞質(zhì)中，靠近細胞膜處陽性信號普遍增強。兩種腫瘤細胞株內(nèi)都能檢測到TMSG-1蛋白，但其表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對比兩種不同轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細胞株，TMSG-1蛋白在PC-3M-21M細胞中的表達明顯高于在PC-3M-IE8細胞株中的表達。故TMSG-1同腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈現(xiàn)負相關(guān)，是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，可在抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

蘇靜等[10]曾經(jīng)對肺巨細胞癌細胞系PG-BEl的研究表明，TMSG-1具有抑制其生長、促進其凋亡、抑制其侵襲能力等重要功能，TMSG-1的表達與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移潛能呈負相關(guān)。同本文前列腺癌細胞系研究結(jié)果一致說明了TMSG-1是可以通過抑制腫瘤增殖能力而影響前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移過程。無論從體內(nèi)實驗還是體外實驗均證實了TMSG-1在抑制腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的重要作用。但TMSG-1是否可在其他腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用及作用機制還需要更進一步討論。

1 裴斐, 由江峰, 寧鈞宇, 等. 人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1單克隆抗體的制備、鑒定及在腫瘤檢測中的應(yīng)用. 中華病理學(xué)雜志 2005; 34(1): 15-21

2 郝玉美, 劉謙, 宋娜玲.前列腺癌干細胞相關(guān)腫瘤標志物的研究進展. 中國腫瘤臨床 2013; 40(19): 1199-1202

3 徐曉艷, 裴斐, 由江峰, 等. 一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1的研究現(xiàn)狀. 癌癥 2010; 29(7): 697-702

4 謝立平, 王瀟. 高危前列腺癌的治療. 中華泌尿外科雜志2012; 33(5): 325-328

5 程亮, 滕曉東, 周杰. 多灶性前列腺癌分子病理及臨床應(yīng)用. 中華病理學(xué)雜志 2011; 40(7): 436-439

6 徐曉艷, 由江峰, 裴斐, 等. 前列腺癌細胞系中TMSG-1的表達及其意義. 臨床與實驗病理學(xué)雜志 2011; 27(1): 40-43

7 蘇靜, 由江峰, 王潔良, 等. 人腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1轉(zhuǎn)染對人乳腺癌細胞MDA-MB-231體外生物學(xué)行為的影響.中華病理學(xué)雜志 2007; 36(10): 672-676

8 金道忠, 朱興族. 神經(jīng)酰胺代謝及凋亡信號調(diào)節(jié). 生命科學(xué) 2006; 18(5): 481-486

9 張秋月, 費素娟. 神經(jīng)鞘磷脂在腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)中的作用研究進展. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2010; 30(8): 558-560

10 蘇靜, 由江峰, 王潔良, 等. 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲能力. 中華腫瘤雜志 2008; 30(6): 404-407

（2014-12-10收稿）

Expression of TMSG-1 in prostate cancer and its clinical signifcance

Sun Xiang, Luo Longhua, Feng Liang
Department of Medical Oncology, the First Affliated Hospitial of Nanchang Univerity, Nanchang 330006, Jiangxi, China

Objective To analyze the expression of TMSG-1 in prostate cancer cells and prostate cancer tissues, and explore its clinical significance. Methods The expression of TMSG-1 in PC-3M-284 cells and PC-3M-IE8 cells was detected by PCR. Invasive ability of cancer cells were evaluated by cell invasion assay. The expression of TMSG-1 in human prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma tissues were measured by immunohistochemical analysis. Results There was a signifcant difference in the expression of TMSG-1 between two prostate cancer cells with different metastatic potential(P＜0.05). The expression of TMSG-1 in PC-3M-2B4 cells was signifcantly higher than that in PGIE8 cells. Immunohistochemical analysis showed that TMSG-1 expression in benign prostate hyperplasia tissues was obviously higher than that in prostate cancer. Cell invasion assay demonstrated that the number of invaded cells in three trnsfected groups(42.31±3.16, 52±1.83 and 23.93±2.79) was signifcant lower than that of the control group (82.01±3.14) and empty vector group (78.00±3.02)(P＜0.05). Conclusion TMSG-1 inhibits the growth of prostate cancer cells, induces apoptosis, and decreases the invasion ability. The expression of TMSG-1 is negatively associated with metastasis potential of tumor cells.

genes, tumor suppressor; prostatic neoplasms; cell Line, tumor; neoplasm metastasis

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.004

R 737.25

資助: 江西省衛(wèi)生廳課題（項目編號：2005-1048）