雷　燕，張會軍，王　娟，張文文，唐紹林，肖　洋，王雪鵬

(1. 廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東　廣州　510515；2. 廣州金水動物保健品有限公司，廣東　廣州　510515；3. 山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東　泰安　271018)

魚類類立克次氏體PCR檢測方法的建立及初步應用

雷燕1,2，張會軍1,2，王娟1,2，張文文1,2，唐紹林1,2，肖洋1,2，王雪鵬3

(1. 廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州510515；2. 廣州金水動物保健品有限公司，廣東廣州510515；3. 山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018)

根據(jù)GenBank中類立克次氏體基因的保守序列，設計一對針對魚類類立克次氏體PCR檢測的特異性通用引物，通過對PCR擴增條件的優(yōu)化，建立快速檢測魚類類立克次氏體的PCR方法，并用該方法對類立克次氏體陽性羅非魚（Oreochromis nilotica）進行PCR擴增，結果得到與實驗設計相符的390 bp的特異性擴增條帶，而對健康羅非魚、烏鱧（Ophiocephalus argus）、海鱸（Dicentrarchus labrax）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）及其他對照組的擴增結果為陰性。測序比對結果證實，該PCR方法檢測結果準確，最低可檢測出約1 pg的類立克次氏體質粒DNA；利用建立的PCR方法，對來自廣東、云南、海南、天津、江蘇、安徽、湖北等地的252份臨床樣品進行檢測，共檢出陽性樣品30份，提示該PCR方法可用于類立克次氏體的臨床快速檢測。

魚類類立克次氏體；PCR檢測；臨床應用

對于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，已明確立克次氏體具有病原學意義，目前，鮭的立克次氏體已明確記述，稱為鮭魚立克次氏體（Piscirickettsia salmonis）[1]，而其他水產(chǎn)動物的立克次氏體未明確記述，稱為類立克次氏體。類立克次氏體為一類嚴格細胞內寄生的原核細胞型微生物，一旦感染，致死率較高。類立克次氏體在體外對鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、土霉素、氟甲喹、惡喹酸、沙拉沙星和克拉霉素敏感，對青霉素、林可霉素、呋喃唑酮、磺胺甲氧芐啶耐受，但臨床口服抗生素療效不一致，可能是由于在宿主細胞內達不到有效的藥物濃度[19]。

自鮭魚立克次氏體首次被確定為魚類病原以來，已報道大西洋鮭（Salmo salar）[2]、大鱗大麻哈（Oncorhynchus tshawytscha）[3]、石斑魚（Epinephelus melanostigma）[4]、羅非魚(Oreochromis nilotica)[5]、海鱸(Dicentrarchus labrax)[6]、真鯛(Pagrosomus major)[7]、銀鮭（Oncorhynchus kisutch）[8]、藍眼隆頭鯰(Panaque suttoni)[8]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[9]、烏鱧（Ophiocephalus argus）[11]等十多種經(jīng)濟魚種感染類立克次氏體而發(fā)病。類立克次氏體也感染其他水生生物，如中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)[10]、砂海螂（Mya arenaria）[12]、紫貽貝（Mytilus Edulis）[13]、硨磲（Tridacna gigas）[14]、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）[15]等。魚類感染類立克次氏體的病理解剖學特征是肝臟、脾臟、腎臟等內臟器官出現(xiàn)白色結節(jié)[4,16-18]，可發(fā)生水平傳播[16, 20]，皮膚和鰓可能是入侵途徑。

由類立克次氏體引起的多種經(jīng)濟魚類和貝類流行性病害已嚴重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并造成巨大的經(jīng)濟損失。目前尚缺乏控制此類病害的有效藥物和方法，因此，建立一種快速、準確、靈敏的檢測方法極為重要。本研究擬建立魚類類立克次氏體的PCR檢測方法，為其臨床快速準確診斷檢測提供一種快速、敏感、準確的技術手段，以便在養(yǎng)殖過程中盡早檢測，及時預防，減少損失。

1　材料和方法

1.1材料

類立克次氏體陽性材料分別為患類結節(jié)病的羅非魚、烏鱧、海鱸，分別采自云南一羅非魚養(yǎng)殖場、廣東佛山一烏鱧養(yǎng)殖場、廣東珠海一海鱸養(yǎng)殖場，由廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司研究所病原分子實驗室（下稱“本實驗室”）收集、鑒定并保存。健康羅非魚、烏鱧、海鱸、中華絨螯蟹分別采自廣東珠海、廣東佛山、廣東珠海、江蘇南京。彈狀病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）、真鯛虹彩病毒（Red sea bream iridovirus，RSIV）、螺原體（Spiroplasma）陽性材料由本實驗室鑒定并保存，pMD19-PLO質粒由本實驗室構建保存。臨床樣品由本實驗室人員分別采自廣東、江蘇等地養(yǎng)殖場。

1.2主要試劑

大腸桿菌DH5α購自北京天根生化科技有限公司，由本實驗室繁殖保存；pMD19-T載體、DNA分子質量標準DL2000購自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR MasterMix、高純度質粒小量抽提試盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3引物設計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的類立克次氏體16S rRNA基因的保守序列（GenBank登錄號：CP012508），設計一對針對魚類類立克次氏體PCR檢測的特異性通用引物。上游引物：5′-CTAGGA GATGAGCCCGCGTTG-3′；下游引物：5′ -ATTTCA CATCCAACTTAATCT-3′，預擴增片段長390 bp，引物由華大基因有限公司合成。

1.4DNA的提取

取類立克次氏體陽性羅非魚的肝臟、脾臟、腎臟組織，加500 μL TN緩沖液（20 mmol /L Tris /HCl，0.4 mol /L NaCl，pH 7.4），用玻璃勻漿器勻漿，于-20 ℃反復凍融3次，低速離心，取上層清液，采用酚-氯仿法提取DNA，保存于-80 ℃下備用。待檢魚類樣品也按照上述方法取樣處理并提取DNA。

1.5PCR檢測及其產(chǎn)物測序驗證

取一PCR反應管，加入2×Taq PCR MasterMix 10 μL，滅菌雙蒸水6 μL，DNA模板3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，共20 μL，渦旋振蕩器上混勻，置于Bio-Rad S1000型PCR儀上擴增，擴增條件：95 ℃下預變性5 min；95℃ 35 s，56 ℃ 40 s，72℃ 40 s，共30個循環(huán)數(shù)，最后72 ℃下末延伸10 min，4 ℃條件下保存，反應結束用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。切取陽性目的片段，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，并與pMD19-T 載體于16 ℃條件下連接12 h，產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)12～14 h后，挑取單個菌落，用LB肉湯擴大培養(yǎng)后，用高純度質粒小量抽提試盒提取質粒并進行PCR鑒定，篩選出含目的片段的陽性重組質粒，送華大基因公司測序，測序結果提交NCBI 中的BLAST進行比對，并利用生物軟件進行序列分析。

1.6PCR反應條件的優(yōu)化

分別取3、2、1 μL抽提的陽性DNA作為模板進行PCR，對模板量進行優(yōu)化；分別取上下游引物各0.25、0.50、1.00 μL進行PCR，對所需引物量進行優(yōu)化。PCR反應程序：95 ℃下預變性5 min；然后95 ℃下變性40 s，分別以51、53、55、57、59 ℃的溫度退火30 s，比較反應產(chǎn)物，獲得最優(yōu)反應程序。

1.7PCR特異性試驗

分別提取健康羅非魚、烏鱧、海鱸、中華絨螯蟹、類立克次氏體陽性羅非魚、SCRV陽性材料、RSIV陽性材料、Spiroplasma陽性材料的核酸，作為模板，按照1.6中優(yōu)化的組分濃度和反應程序進行PCR反應，觀察反應的特異性。

1.8PCR敏感性試驗

測定pMD19-PLO質粒的含量，按10倍遞增稀釋成10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL、100 fg/mL、10 fg/mL、1 fg/mL，分別以各濃度梯度的質粒作為模板，根據(jù)1.6中已獲得的最佳反應體系和反應程序進行PCR，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，檢測模板的最低檢測量。

1.9臨床樣品檢測試驗

應用本研究建立的PCR檢測方法，對來自廣東、云南、海南、天津、江蘇、安徽、湖北等地的252例羅非魚、烏鱧、海鱸、中華絨螯蟹臨床樣品進行檢測，檢驗其準確性及臨床實用性。

2　結 果

2.1PCR檢測方法的建立

利用設計的特異性引物，對類立克次氏體陽性羅非魚、烏鱧、海鱸樣品進行PCR檢測，均可擴增出與目的條帶大小相符的特異性片段（圖2）。將PCR陽性產(chǎn)物分別回收、克隆并測序，得到一條長390 bp的序列，其與GenBank中發(fā)布的類立克次氏體的基因序列相比，同源性為99.5%。

2.2PCR反應條件的優(yōu)化

通過對不同反應條件下的擴增，以及PCR產(chǎn)物電泳結果的比較，確定優(yōu)化的反應體系為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，滅菌雙蒸水6 μL，DNA模板 3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.50 μL。優(yōu)化的反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃下循環(huán)變性40 s，57 ℃下退火復性40 s，72℃下延伸40 s，30循環(huán)；72 ℃下末延伸10 min，4 ℃條件下保存。

圖2　類立克次氏體陽性樣品PCR檢測結果Fig. 2　Results of PCR detection of Rickettsia-like organisms positive samples

2.3PCR特異性擴增結果

分別以健康羅非魚、烏鱧、海鱸、中華絨螯蟹，類立克次氏體陽性羅非魚、烏鱧、海鱸，SCRV陽性材料，RSIV陽性材料，Spiroplasma陽性材料的核酸為模板進行PCR，結果僅類立克次氏體陽性羅非魚、烏鱧和海鱸可擴增出與預期大小相符的目的條帶，而健康羅非魚、烏鱧、海鱸、中華絨螯蟹及其他對照組均未擴增出任何條帶（圖3）。

圖3　特異性擴增結果Fig.3　The result of specifical amplification

2.4PCR敏感性擴增結果

經(jīng)過敏感性測定，該PCR檢測方法最低能檢出1 pg的pMD19-PLO質粒模板（圖4）。

圖4　敏感性試驗結果Fig. 4　Result of sensitivity detect

2.5臨床檢測結果

用建立的類立克次氏體的PCR檢測方法，對252份來自廣東、云南、海南、天津、江蘇、安徽、湖北等地魚類的臨床樣品進行檢測，結果見表1。

表1　應用建立的PCR檢測方法對不同地區(qū)臨床樣品類立克次氏體的檢測結果Table 1　Detection results of piscirickettsia-like organisms in different areas clinical samples using PCR

3　討 論

PCR檢測技術具有快速、準確、靈敏的特點，已廣泛應用于水產(chǎn)生物疾病的研究及病原體檢測。本研究參照GenBank中公布的基因序列，在類立克次氏體基因的保守序列中設計一對通用特異性檢測引物，建立魚類類立克次氏體的PCR檢測方法，在PCR檢測過程中，所選擇的反應體系和反應程序對結果均有影響，通過優(yōu)化對PCR反應體系和反應程序進行篩選，得出最適反應體系和反應程序。特異性試驗表明，分別以健康羅非魚、烏鱧、海鱸、中華絨螯蟹，類立克次氏體陽性羅非魚、烏鱧、海鱸，SCRV陽性材料，RSIV陽性材料，Spiroplasma陽性材料提取的DNA為模板，結果僅類立克次氏體陽性材料有特異條帶，這說明所設計的該對引物特異性很好。敏感性試驗表明，以所構建的按10n倍稀釋的pMD19-PLO質粒為模板，當稀釋至1 pg時，PCR結果還為陽性，說明敏感性較好。針對魚類類立克次氏體進行檢測，最快可以在4 h內完成實驗，從發(fā)病魚樣品中確診魚類類立克次氏體病原。利用所建立的PCR檢測方法，共檢測了252份疑似樣品，結果有30份為陽性，為了進一步驗證該方法的準確性，本研究對PCR陽性目的條帶分別送3家不同的測序公司進行測序，目的片段經(jīng)比對均為類立克次氏體的基因片段。

綜上所述，本研究建立了一種快速、簡便、靈敏的檢測魚類類立克次氏體的PCR的方法，研究表明，與傳統(tǒng)的方法相比，該方法具有靈敏性和特異性好、且耗時少的特點，與以往的類立克次氏體PCR檢測方法比較，具有較好的廣譜性。因此，該方法的建立為魚類類立克次氏體的快速診斷、病原調查及常規(guī)檢測提供了技術支撐。

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（責任編輯：劉慶穎）

Development and Primary Application of a PCR Assay for Detection of Piscirickettsia-like Organisms

LEI Yan1,2, ZHANG Hui-jun1,2, WANG Juan1,2, ZHANG Wen-wen1,2, TANG Shao-lin1,2, XIAO Yang1,2, WANG Xue-peng3
(1. Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co. Ltd, Guangzhou 510515, China; 2. Guangzhou Jinshui Animal Health Products Co. Ltd, Guangzhou 510515, China; 3. College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

According to the published gene sequences of the piscirickettsia-like organisms in GenBank, a pair of specific primers was designed, and a rapid PCR method was established for detecting fish piscirickettsia-like organisms. The reaction parameters were optimized to develop the PCR method for detecting fish piscirickettsia-like organisms. The specific band of 390 bp were amplified from the positive samples, but no specific band was amplified from healthy Oreochromis nilotica, Ophiocephalus argus, Dicentrarchus labrax, Eriocheir sinensis and other control group. Sequencing analysis indicated that this method was accurate, and the minimal amount of DNA plasmid of piscirickettsia-like organisms that could be detected was 1 pg. 252 clinical fish samples from Guangdong, Yunnan, Hainan, Tianjin, Jiangsu, Anhui, Hubei were tested by the PCR, and 30 of which were positive. The results indicated that the PCR assay could be used for the detection of clinical fish samples.

piscirickettsia-like organisms; PCR detection; clinical application

S941.4

A

1673-9159（2015）06-0030-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2015.06.006

2015-08-28

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（SDAIT-19）；泰安市科技發(fā)展計劃項目（201440774）；浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室開放基金項目（J2013006）

雷燕（1983—）， 男，碩士，研究方向為養(yǎng)殖水產(chǎn)動物病害防治。E-mail: leikunnuy@163.com

王雪鵬（1980—）男，博士，副教授，研究方向為水生動物病原分子生物學、水產(chǎn)動物病害。Email: xpwang@sdau.edu.cn