張 偉

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，結(jié)核病可蔓延至全身各個(gè)器官，但以肺臟為主，并通過呼吸道傳播［1，2］。該病目前無徹底治愈的方法，臨床主要以殺菌以及對癥治療為主，但部分患者停藥后結(jié)核病又復(fù)發(fā)，病情甚至較之前加重。根據(jù)我院多年臨床結(jié)核患者治療資料顯示，于結(jié)核發(fā)病早期對患者進(jìn)行積極化療，能有效提高臨床療效，將結(jié)核控制在較小范圍。此外，對于部分耐藥菌的診斷更是重中之重，因結(jié)核病治療周期較長，早期發(fā)現(xiàn)耐藥菌，可以提早使用針對性藥物，為結(jié)核治療爭取更多時(shí)間，需要在臨床加以重視［3－6］。結(jié)核桿菌耐藥基因芯片診斷能有效增加結(jié)核桿菌耐藥菌檢出率，且該方法快速簡便，可大規(guī)模開展［7，8］。為此，我院對116 株結(jié)核菌株進(jìn)行檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 檢測材料結(jié)核分支桿菌均由我院檢驗(yàn)部提供，包括臨床分離培養(yǎng)的結(jié)核桿菌菌株84 株(包括活檢、肺泡或支氣管灌洗以及胸腔積液中分離的菌株)以及痰標(biāo)本結(jié)核桿菌菌株64 例。分離培養(yǎng)的結(jié)核桿菌以及痰標(biāo)本均搜集自本院2013 年5 月至2015 年5 月于我院收治的結(jié)核病患者。以上菌株均于我院按照結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行分離培養(yǎng)以及鑒定。菌株培養(yǎng)采用改良羅氏法，細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)采用絕對濃度法。

1.2 方法用取菌環(huán)刮取培養(yǎng)基上的菌落，將菌落溶于10 mL 雙蒸水，用玻璃棒攪拌后放入離心機(jī)。以12 000 r/min 離心10 min，去除過濾出沉淀物，倒去上清液，用雙蒸水繼續(xù)溶解混勻，加入700 μmol/L 氫氧化鈉溶液靜置2 h，繼續(xù)以12 000 r/min 離心10 min，濾出沉淀，用雙蒸水洗凈后，依次加入適量裂解液，吸附劑，煮沸，震蕩后離心10 min，取上清液，用UNIQ-10柱對上清進(jìn)行純化并濃縮至150 μL 以待PCR 反應(yīng)。隨后分別經(jīng)過rpoB 基因擴(kuò)增、陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、濃縮、測序以及測序產(chǎn)物的純化。最后將產(chǎn)物用310型全自動(dòng)DNA 測序儀(南京金斯瑞生物科技有限公司)進(jìn)行測序，觀察并記錄下測序結(jié)果。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判定采用WHO 公布的標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌在40 ～50 μg/mL 的異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)的培養(yǎng)基上可以生長即判定為耐藥。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例或百分比表示，統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法結(jié)果比較我院按照全國結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行分支桿菌分類以及鑒定，選取臨床分離的結(jié)核桿菌84 株，其中耐INH 和耐RFP 菌株67 株，INH 或RFP 敏感菌株17 株?；驒z測中耐藥菌株69 株，65 株結(jié)果正確，敏感株檢出15 株，13 株符合真實(shí)結(jié)果。耐藥基因檢測法靈敏度為97.01%，特異度為76.52%。陽性預(yù)測值為94.24%，陰性預(yù)測值為86.73%，兩種檢測方法的靈敏度和特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.19，P ＞0.05)。見表1。

2.2 兩種檢測方法痰標(biāo)本檢測結(jié)果比較我院選取痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌64 株，其中耐INH 和RFP 菌株32株，INH 或RFP 敏感菌株32 株。基因檢測結(jié)果中耐藥菌株36 株，28 株結(jié)果與羅氏培養(yǎng)結(jié)果一致，敏感株檢出28 株，24 株符合真實(shí)結(jié)果。耐藥基因檢測法靈敏度為87.56%，特異度為75.00%。陽性預(yù)測值為77.81%，陰性預(yù)測值為85.73%，與羅氏培養(yǎng)檢驗(yàn)的敏感度和特異度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.17，P ＞0.05)。見表2。

表1 兩種檢測方法分離菌株檢測結(jié)果比較(例)

表2 兩種檢測方法痰標(biāo)本檢測結(jié)果比較(例)

2.3 耐藥結(jié)核桿菌基因檢測結(jié)果耐藥結(jié)核桿菌檢測結(jié)果如下:基因突變片段為516Mat 12 株，基因突變片段為526Mcg8 株，基因突變片段為526Mct 5 株，基因突變片段為526Mag 5 株，基因突變片段為531Mct 40 株，基因突變片段為516Mgt 5 株，其它基因突變片段14 株，可見耐藥基因突變片段以531Mct 為主，其次為516Mat、526Mcg 以及526Mct、526Mag、516Mgt 等。

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌感染引起的慢性傳染病，結(jié)核病可侵犯人體多個(gè)系統(tǒng)，如呼吸、循環(huán)、免疫系統(tǒng)，對人體造成極大的損害［9，10］。雖然我國加大了結(jié)核病的防治力度，總的發(fā)病增長率有所下降，但我國結(jié)核病患者基數(shù)仍然比較龐大，需引起重視。結(jié)核的治療是一個(gè)長期過程，目前各種關(guān)于結(jié)核桿菌藥物的研究正在開展，但與此同時(shí)，隨著抗結(jié)核藥的廣泛使用，以及部分患者藥物濫用，各地不斷報(bào)道有多耐藥結(jié)核桿菌(multi drug resistant mycobacterium tuberculosis，MDR-TB)的出現(xiàn)。2002 ～2006 年，WHO 在進(jìn)行了大規(guī)模的結(jié)核調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示多耐藥結(jié)核菌正在全球迅速蔓延;在WHO 對全球184 個(gè)國家結(jié)核病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，新近結(jié)核桿菌感染患者中出現(xiàn)242 794例MDR-TB 感染者，約占2.7%。而既往已接受治療的患者中MDR-TB 感染率甚至達(dá)到了18.5%［11，12］。此外，同時(shí)感染HIV 和結(jié)核桿菌的患者中56%感染了MDR-TB。更加令人擔(dān)憂的是部分地區(qū)對于多耐藥結(jié)核桿菌的診斷受到多種因素的制約，無法第一時(shí)間對多耐藥結(jié)核桿菌做出診斷，導(dǎo)致患者在長期使用各種常規(guī)化療藥物治療后病情仍無緩解，甚至加重。臨床常用的結(jié)核桿菌耐藥性檢查就是藥敏試驗(yàn)，但該方法對于設(shè)備以及操作的要求較高，部分地區(qū)醫(yī)院無法開展［13］。此外，操作中失誤很容易造成最后結(jié)果出現(xiàn)假陽性或者假陰性，因此在臨床難以普及。近年來，也有學(xué)者提出多種檢測耐藥菌株的方法，如:噬菌體熒光素酶法、氧化還原酶活性檢測、BACTEC、微孔法［14，15］等，但要滿足臨床檢測，尚需深入研究，以縮短檢查所需時(shí)間。本研究主要針對結(jié)核病患者的耐藥基因芯片檢測技術(shù)，通過對116 株結(jié)核桿菌菌株進(jìn)行研究，取得了一定的成果。

我院按照全國結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程進(jìn)行分支桿菌分類以及鑒定，選取臨床分離的結(jié)核桿菌84株，其中耐INH 和耐RFP 菌株67 株，INH 或RFP 敏感菌株17 株?；驒z測中耐藥菌株69 株，65 株結(jié)果正確，敏感株檢出15 株，13 株符合真實(shí)結(jié)果。耐藥基因檢測法靈敏度為97.01%，特異度為76.52%。陽性預(yù)測值為94.24%，陰性預(yù)測值為86.73%，兩種檢測方法無明顯差異。基因檢測技術(shù)對于分離培養(yǎng)的耐藥結(jié)核菌株的檢出，與藥敏法無明顯差異，效果可靠。我院選取痰標(biāo)本中結(jié)核桿菌64 株，其中耐INH 和耐RFP菌株32 株，INH 或RFP 敏感菌株32 株?；驒z測中耐藥菌株36 株，28 株結(jié)果與羅氏培養(yǎng)結(jié)果一致，敏感株檢出28 株，24 株符合真實(shí)結(jié)果。耐藥基因檢測法靈敏度為87.56%，特異度75.00%。陽性預(yù)測值為77.81%，陰性預(yù)測值為85.73%，兩種檢測方法檢驗(yàn)效果無明顯差異?；驒z測技術(shù)對于痰標(biāo)本中的耐藥結(jié)核菌株的檢出，與藥敏法無明顯差異，效果可靠?；蛲蛔兤畏謩e為516Mat 12 株、526Mcg 8 株、526Mct 5株、526Mag 5 株、531Mct 40 株、516Mgt 5 株、其它基因突變片段14 株，可見耐藥基因突變片段以531Mct 為主，其次為516Mat、526Mcg 以及526Mct、526Mag、516Mgt等，臨床對于結(jié)核桿菌基因型診斷需引起重視。

綜上所述，結(jié)核桿菌耐藥基因芯片檢測技術(shù)，檢測結(jié)果與羅氏培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，且用時(shí)較培養(yǎng)短，可大規(guī)模操作，值得在臨床廣泛推廣。

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