李麗麗 夏瑞祥

急性髓細(xì)胞性白血病(acute meloid leukemia，AML)是一類造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，為最常見的成人血液惡性腫瘤。影響AML 預(yù)后重要因素是細(xì)胞遺傳學(xué)，但仍有40%～45%正常核型AML 的治療反應(yīng)、長期生存情況差異明顯。隨著髓細(xì)胞白血病的分子生物學(xué)研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)一些基因表達(dá)異常或突變，如ERG、MN1、FLT3-ITD 及NPM1 等對AML 的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著重要影響［1，2］。同源異型盒基因5(Homeobox gene 5，HOXA5)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其與AML存在關(guān)聯(lián)。本研究使用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RTQ-PCR)對成人AML 中的HOXA5 表達(dá)情況進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2009 年12 月至2011 年2 月我院初診成人AML 患者108 例，正常對照為10 例同期門診患者(白細(xì)胞減少癥、脾功能亢進(jìn)、缺鐵性貧血)。初診成人AML 患者均使用IA(3+7)或DA(3+7)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案治療，化療1 個療程后復(fù)查骨髓判斷療效。108 例AML 患者中，原發(fā)性AML 97 例、繼發(fā)性AML 11 例(9例骨髓增生異常綜合征化的AML，2 例慢性粒細(xì)胞白血病急變的AML);標(biāo)準(zhǔn)方案誘導(dǎo)治療AML 共92 例，未治療16 例;初次誘導(dǎo)治療完全緩解(complete response 1，CR1)57 例，未完全緩解(no response 1，NR1)35 例;年齡≥60 歲18 例，年齡＜60 歲90 例;男性64 例，女性44例。所有初診成人AML 患者診斷及分型均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［3］。

1.2 方法使用RTQ-PCR 檢測骨髓HOXA5 表達(dá)量。

1.2.1 標(biāo)本制備 Ficoll 分離法提取2 mL EDTA 抗凝骨髓中的單個核細(xì)胞，保存在-80℃中備用。

1.2.2 RTQ-PCR 在單個核細(xì)胞中抽提RNA 并測量其濃度。取1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以ABL 為內(nèi)參基因，取1 μL cDNA 以95℃預(yù)變性2 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，共40 個循環(huán);72℃延伸7 min 為擴增條件，HOXA5 的引物序列為F5'-AGATCTACCCCTGGATGCGC-3'、 R5'- CCTTCTCCAGCTCCAGGGTC-3'進(jìn)行普通PCR 擴增，其擬擴增產(chǎn)物大小為212 bp。取5 μL 擴增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，條帶與理論值相同且清晰單一。2 次引物驗證均成功后，取引物1 μL(上下游)、Real-Time PCR 儀中先后加入2 μL cDNA、6.6 μL DEPC 水、10 μL SYBR Green 經(jīng)95℃20 s 預(yù)變性，95℃3 s、60℃30 s，共36個循環(huán);95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s，得出溶解曲線。溶解曲線單一峰型，溶解溫度與驗證時相近，復(fù)孔CT 值標(biāo)準(zhǔn)差≤0.2;陰性對照沒有起峰，或溶解曲線峰型比較雜亂，且CT 值超過35。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料呈非正態(tài)分布，組間比較使用非參數(shù)檢驗，計數(shù)資料統(tǒng)計分析使用χ2檢驗，計數(shù)資料相關(guān)性使用Spearman 相關(guān)性分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RTQ-PCR 檢測結(jié)果檢測出數(shù)據(jù)為HOXA5 表達(dá)量，Realtime PCR 產(chǎn)物溶解曲線圖見圖1、圖2，擴增產(chǎn)物電泳圖見圖3。

2.2 HOXA5 在AML 與正常人中的表達(dá)初診AML與正常對照的HOXA5 表達(dá)量經(jīng)正態(tài)分布檢驗后不符正態(tài)分布，初診AML 與正常對照人群的HOXA5 進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.68，P=0.40)。

2.3 AML 患者HOXA5 表達(dá)的ROC 曲線108 例AML 的HOXA5 表達(dá)情況繪制ROC 曲線見圖4，AUC=0.57，P=0.50。以cut-off=2.70 為界，HOXA5高表達(dá)39 例，低表達(dá)69 例。

2.4 HOXA5 表達(dá)與AML 病因的關(guān)系原發(fā)性AML患者中，HOXA5 高表達(dá)34 例、低表達(dá)63 例;繼發(fā)性AML 患者中，HOXA5 高表達(dá)5 例、低表達(dá)6 例。原發(fā)性與繼發(fā)性AML 患者的HOXA5 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.50)，見表1。

2.5 HOXA5 表達(dá)與初次誘導(dǎo)治療緩解的關(guān)系CR1患者中，HOXA5 高表達(dá)15 例、低表達(dá)42 例;NR1 患者中，HOXA5 高表達(dá)21 例，低表達(dá)14 例。CR1 與NR1患者的HOXA5 表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)，見表1。

2.6 HOXA5 表達(dá)與年齡的關(guān)系年齡≥60 歲患者中，HOXA5 高表達(dá)4 例、低表達(dá)14 例;年齡＜60 歲患者中，HOXA5 高表達(dá)35 例、低表達(dá)55 例。年齡≥60歲與＜60 歲AML 患者的HOXA5 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.18)，見表1。

2.7 HOXA5 表達(dá)與性別的關(guān)系男性AML 患者64例，其中HOXA5 高表達(dá)11 例、低表達(dá)46 例;女性AML 患者44 例，其中HOXA5 高表達(dá)21 例、低表達(dá)23例。不同性別AML 患者的HOXA5 表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)，見表1。

表1 AML 患者HOXA5 表達(dá)情況

2.8 HOXA5 表達(dá)與各因素相關(guān)性HOXA5 表達(dá)與CD34、HLA-DR、CD33、WBC 計數(shù)、LDH 無相關(guān)性(P ＞0.05)，而HOXA5 與骨髓原始細(xì)胞數(shù)有相關(guān)性(P ＜0.05)，見表2。

3 討論

AML 是一組異質(zhì)性疾病，其發(fā)病與多種因素相關(guān)，伴隨臨床特征、治療反應(yīng)及長期生存的很大差異。隨著研究深入，病因、年齡、FAB 分型、免疫學(xué)等明確是影響AML 預(yù)后因素［4］，一些細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)改變的可成為最重要影響因素，甚至是獨立預(yù)后因素。

同源異型盒基因是定位于脊椎動物的第2(2q31)、7(7p15.3)、12(17p21.3)、17(12q13.3)染色體上轉(zhuǎn)錄因子家族成員，調(diào)控著胚胎發(fā)育和造血干細(xì)胞分化［5］。在結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等多種腫瘤組織中異常表達(dá)。國外研究［6］證實同源異型基因通過造血干細(xì)胞增殖、分化及凋亡參與惡性血液腫瘤發(fā)生發(fā)展過程并與其預(yù)后密切相關(guān)。

同源異型基因家族成員中，在胚胎發(fā)育和干細(xì)胞分化發(fā)揮關(guān)鍵作用是HOXA5 基因，它定位于第7 號染色體上。HOXA5 基因可通過激活p53 依賴途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，其低表達(dá)可能誘發(fā)乳腺癌的發(fā)生［7］，說明HOXA5 對實體腫瘤的發(fā)生是有一定作用的，也可能在血液腫瘤的發(fā)生中起著作用。

本研究中AML 患者與正常對照的HOXA5 表達(dá)無明顯差異，但這不能說明HOXA5 與AML 的發(fā)病沒有相關(guān)性。已有研究［8］證實HOXA5 基因與某些染色體易位的關(guān)聯(lián)作用可以影響白血病的發(fā)生發(fā)展，更是髓系干細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。但需要進(jìn)一步研究HOXA5 與哪些染色體存在何種易位失聯(lián)作用，而對AML 的發(fā)生產(chǎn)生作用，證實HOXA5 與AML 發(fā)生是否存在相關(guān)性。

Drabkin 等［9］研究表明HOXA5 基因高表達(dá)，預(yù)示著AML 和混合表型白血病不良預(yù)后。HOXA5 基因表達(dá)高低是AML 預(yù)后的影響因素之一，其高表達(dá)則有著較差預(yù)后［10］。且已有研究提出HOXA5 異常表達(dá)可能影響AML 預(yù)后［11］。

本文標(biāo)準(zhǔn)方案初次誘導(dǎo)治療CR1 患者中，HOXA5高表達(dá)15 例、低表達(dá)42 例;NR1 的AML 中，HOXA5高表達(dá)21 例、低表達(dá)14 例。HOXA5 高表達(dá)者有著較低緩解率，這說明HOXA5 表達(dá)可能影響AML 對治療的反應(yīng)，高表達(dá)可能預(yù)示著較低緩解率。原發(fā)性與繼發(fā)性AML、年齡≥60 歲與＜60 歲AML 患者的HOXA5表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義，說明HOXA5 表達(dá)與病因及年齡可能無明顯相關(guān)。而男性AML 中HOXA5 高表達(dá)11例、低表達(dá)46 例;女性中HOXA5 高表達(dá)21 例、低表達(dá)23 例，男性與女性AML 的HOXA5 表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明HOXA5 在男性AML 患者中表達(dá)低，但需進(jìn)一步擴大樣本量驗證。對初診成人AML 患者的HOXA5 表達(dá)繪制ROC 曲線，提示HOXA5 有較低準(zhǔn)確性，其表達(dá)對AML 治療療效或者預(yù)后可能存在提示意義，需進(jìn)一步擴大樣本量檢測HOXA5 表達(dá)。HOXA5表達(dá)與CD34、HLA-DR、CD33、WBC 數(shù)及LDH 均無相關(guān)性，說明HOXA5 與初診AML 的一些臨床特征無關(guān)聯(lián)。但HOXA5 與骨髓原始細(xì)胞數(shù)有相關(guān)性，說明HOXA5 表達(dá)與骨髓原始細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)，骨髓原始細(xì)胞數(shù)高可能增加了化療風(fēng)險，療效減低，這可能亦與AML 較低緩解率有關(guān)。

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