肖晶鑑 岳海英 韋婷婷 周平婷 康 敏 王仁生

食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于全球惡性腫瘤第八位，致死率為第六位，其發(fā)病率近年來(lái)逐步上升［1，2］。食管癌治療的主要手段有手術(shù)治療、放療和化療等。由于食管癌起病隱匿，早期癥狀不典型、臨床缺乏有效的早期診斷方法，且食管黏膜下有豐富的毛細(xì)淋巴管網(wǎng)，以致70%～80%的食管癌患者確診時(shí)已出現(xiàn)淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因而目前晚期食管癌仍以藥物治療為主，但總體療效并不理想［3］。因此，探索食管癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，確立防治靶點(diǎn)，尋求新的干預(yù)策略對(duì)提高食管癌的療效具有特殊的重要性和迫切性。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討MicroRNA-129-2 靶向調(diào)控SOX4 抑制食管癌細(xì)胞增殖與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用及作用機(jī)制，同時(shí)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察MicroRNA-129-2 對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料食管癌細(xì)胞株NMC109 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。雄性裸鼠60 只(SPF級(jí))，體質(zhì)量18 ～22 g(4 ～5 周)，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM 低糖細(xì)胞培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn);質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn);LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒由Invitrogen 公司提供;嘌呤霉素為sigma 公司生產(chǎn);SOX4多克隆抗體由cell signaling 公司提供;載體miRNASelectTMpEGP-miR 為美國(guó)Cell Biolabs 公司生產(chǎn);MTT 由美國(guó)SIGMA 公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 食管癌細(xì)胞NMC109 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM 低糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。miR-129-2 mimics 及miR-129-2 mimics NC 由廣州銳博公司合成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM2000 試劑盒進(jìn)行，方法參照試劑盒提供的使用說(shuō)明。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48 h 后加嘌呤霉素篩選陽(yáng)性克隆。

1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的miR-129-2 mimics(高表達(dá)組)、miR-129-2 mimics NC(mimics NC 組)和未處理的NMC109(空白對(duì)照組)細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)，接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，使每孔細(xì)胞密度為5 000 個(gè)，每組設(shè)4 個(gè)平行孔并設(shè)不含細(xì)胞的校正孔，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁，將96 孔板置于37℃，含5%CO2及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，于終止前4 h，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后棄去上清液，加入150 μL 二甲基亞砜，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解，于490 nm 波長(zhǎng)處在熒光酶聯(lián)分析儀上測(cè)光吸收值(A 值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 同樣設(shè)立上述3 組。在Boyden 小室下室加入含10%FBS 的完全培養(yǎng)基，上、下室之間鋪有聚碳酸酯微孔濾膜(直徑13 mm、孔徑8 μm)，膜上均勻鋪50 μg/孔的人工基底膜膠(Matrigel，BD 公司)，37 ℃溫箱聚合30 min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液400 μL(2×104個(gè)細(xì)胞)加入上室，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。吸去上室液體，擦去膜表面未侵襲的細(xì)胞及Matrigel 膠，生理鹽水漂洗，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色。每組設(shè)3 個(gè)平行樣本，隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)400 倍顯微視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)，取其平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 Western Blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá) 分別收集上述細(xì)胞用蛋白裂解液處理之后離心取上清，分別取各組蛋白30 μL 于8%SDS-PAGE 電泳電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用脫脂奶粉封閉1 h，覆上SOX4 兔單抗(1 ∶100)過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶200)，37℃孵育1 h，洗膜后含化學(xué)發(fā)光劑A、B 的水溶液中激發(fā)熒光，在暗室中壓X 片，然后顯影、定影，應(yīng)用Quantity One 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 裸鼠異種移植瘤動(dòng)物模型的建立 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高表達(dá)組、mimics NC 組的細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞分別經(jīng)胰酶消化、離心、收集、計(jì)數(shù)后，制備成5×107 個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液注入裸鼠腋窩中部背側(cè)皮下，每只裸鼠腋下接種0.2 mL，約1 周后接種原位出現(xiàn)腫瘤，每3 d 測(cè)量1 次各組裸鼠的體重和瘤體大小。每組接種裸鼠20 只。測(cè)量瘤體最長(zhǎng)徑(a)與最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=πab2/6。觀察30 d 后，處死裸鼠，取瘤組織，稱(chēng)瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1－處理組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)×100%;腫瘤相對(duì)體積:RTV=Vt/V0，Vt 為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤體積，V0 為腫瘤初始體積;相對(duì)腫瘤增殖率:T/C(%)=RTV 處理組/RTV 對(duì)照組×100%。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s 表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖作用如圖1 及表1 所示，miR-129-2 高表達(dá)組、空白對(duì)照組、miR-129-2 mimics NC 組24 小時(shí)時(shí)已開(kāi)始出現(xiàn)差異(F=10.419，P ＜0.05);自48 小時(shí)起差異逐漸增大(F=317.336，P ＜0.001);第72 小時(shí)(F=84.097，P ＜0.001);96 小時(shí)(F=215.675，P ＜0.001);120 小時(shí)(F=362.735，P ＜0.001)。提示miR-129-2 能顯著降低食管癌NMC109 細(xì)胞的增殖能力，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用越明顯。

2.2 Transwell 穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲力高表達(dá)組及mimics NC 組平均通過(guò)細(xì)胞數(shù)分別為(350.00±24.02)個(gè)、(699.67±17.79)個(gè)。空白對(duì)照組的NMC109 細(xì)胞組平均通過(guò)細(xì)胞數(shù)為(703.00±18.36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=350.00，P ＜0.001)。詳見(jiàn)圖2。

2.3 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了miR-129-2 mimics 的食管癌NMC109 細(xì)胞中SOX4 蛋白表達(dá)量(0.10±0.004)比轉(zhuǎn)染miR-129-2 mimics NC 的細(xì)胞中SOX4 蛋白表達(dá)量(0.34±0.028)和空白對(duì)照組(0.43±0.011)明顯減少，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=279.602，P ＜0.001)。詳見(jiàn)圖3。

表1 miR-129-2 質(zhì)粒對(duì)NMC109 細(xì)胞不同時(shí)間增殖活性的影響±s)

表1 miR-129-2 質(zhì)粒對(duì)NMC109 細(xì)胞不同時(shí)間增殖活性的影響±s)

注:高表達(dá)組vs 空白對(duì)照比較，*P ＜0.05;高表達(dá)組vs mimicsNC 組比較，ΔP ＜0.05

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2.4 miR-129-2 對(duì)裸鼠體質(zhì)量及移植瘤重的影響實(shí)驗(yàn)中各組無(wú)一例死亡，miR-129-2 mimics 荷瘤組、miR-129-2 mimics NC 荷瘤組及空白對(duì)照組體質(zhì)量差異均未超過(guò)20%。miR-129-2 mimics NC 組與空白對(duì)照組裸鼠于左側(cè)腋下注射細(xì)胞后的第7 天出瘤，miR-129-2 mimics 組在注射后的第10 天可測(cè)得瘤體體積。轉(zhuǎn)染miR-129-2 mimics 的食管癌NMC109 細(xì)胞移植瘤具有明顯的抑瘤作用(圖4)，根據(jù)定期測(cè)得的瘤體長(zhǎng)、短徑計(jì)算瘤體體積并繪制生長(zhǎng)曲線(圖5)，各組瘤體濕重分別為:miR-129-2 mimics 組(0.90±0.03)g、空白對(duì)照組(1.17±0.05)g、miR-129-2 mimics NC 組(1.16±0.07)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.08，P ＜0.01)，詳見(jiàn)圖6、7。各組瘤體終體積和相對(duì)腫瘤體積:miR-129-2mimic 組為(278.52±31.10)mm3、(8.70±3.10)，空白對(duì)照組為(1041.44±69.69)mm3、(17.78±2.37);miR-129-2mimics NC 組為(1022.26±61.92)mm3、(18.80±4.48)。3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=352.714，P ＜0.001;F=15.755，P ＜0.001)。詳見(jiàn)表2。miR-129-2 mimics NC 組及空白對(duì)照組間無(wú)明顯差異(P ＞0.05)。miR-129-2 高表達(dá)組抑瘤率為22.1%，相對(duì)腫瘤增殖率為46.3%，miR-129-2mimics NC 組抑瘤率為1.1%，相對(duì)腫瘤增殖率為94.59%。

3 討論

基因干預(yù)性治療是目前探索腫瘤防治的研究熱點(diǎn)，在眾多的癌基因表達(dá)調(diào)控的研究中，microRNA 的作用已經(jīng)越來(lái)越受到重視。microRNA 是一種真核生物內(nèi)源性小分子單鏈RNA，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼小RNA。miRNAs 在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等方面有重要的作用，并對(duì)真核生物基因的表達(dá)有調(diào)控作用。miRNA 分子通過(guò)形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體與靶基因3‘端非翻譯區(qū)不完全互補(bǔ)結(jié)合，通過(guò)誘導(dǎo)mRNA 的切割降解、翻譯抑制或者其他形式的調(diào)節(jié)機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)。目前，miRNA分子及其靶基因的研究已成為基因調(diào)控研究領(lǐng)域的重要分子和熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的miRNA 位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域，部分miRNA 在多種腫瘤中異常表達(dá)［4］。有文獻(xiàn)證實(shí)miRNA 的失調(diào)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用［5］。

某些癌基因不僅是腫瘤組織的標(biāo)志，而且在生物學(xué)功能上影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SOX 基因家族有32個(gè)成員，其中SOX4 在腫瘤中的作用尤其引人關(guān)注，該家族為控制發(fā)育的基因家族，在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中對(duì)性別分化及組織器官形成起重要作用。近年來(lái)大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)SOX4 在多種腫瘤中高表達(dá)，如前列腺癌［6］，乳腺癌［7］和肺癌［8］等，這些研究結(jié)果表明SOX4 是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的癌基因。此外，SOX4 基因與腫瘤的演進(jìn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的作用也得到大量研究結(jié)果證實(shí)。近年研究均指出SOX4 基因在胃癌、肺癌和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9－11］。由此顯示SOX4 基因的高表達(dá)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。

表2 3 組間裸鼠移植瘤瘤體濕重、終體積、腫瘤相對(duì)體積的比較(±s)

表2 3 組間裸鼠移植瘤瘤體濕重、終體積、腫瘤相對(duì)體積的比較(±s)

注:高表達(dá)組vs 空白對(duì)照，*P ＜0.05;高表達(dá)組vs mimics NC 組比較，ΔP ＜0.05

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本課題組前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中SOX4蛋白高表達(dá)與食管癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而miR-129-2分子在食管癌組織中表達(dá)顯著下調(diào);熒光素酶活性分析報(bào)告也證實(shí)SOX4 基因是miR-129-2 的直接作用靶標(biāo)。本研究通過(guò)向NMC109 細(xì)胞中轉(zhuǎn)入外源性miR-129-2mimics，觀察其在體內(nèi)外上調(diào)miR-129-2 表達(dá)后食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-129-2mimics 的NMC109 細(xì)胞的體外增殖和侵襲的能力受到明顯的抑制，同時(shí)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果表明上調(diào)miR-129-2 后，NMC109 細(xì)胞中的SOX4 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比有明顯的下調(diào)。這一結(jié)果與前期實(shí)驗(yàn)研究相互印證，證實(shí)了miR-129-2 對(duì)SOX4 蛋白的調(diào)控作用。綜合上述結(jié)果表明，上調(diào)miR-129-2 表達(dá)后所呈現(xiàn)的抑瘤作用和抑制轉(zhuǎn)移作用與下調(diào)SOX4 蛋白表達(dá)有關(guān)。裸鼠移植瘤模型中腫瘤的生長(zhǎng)同樣受到明顯抑制，這一現(xiàn)象的發(fā)生是否同體外實(shí)驗(yàn)具有相同的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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