王 晶，周 達(dá)，丁永年，彭媛媛，何嶺楠，陳源文，范建高

肝纖維化是各種慢性肝病肝損傷發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理學(xué)過程[1]，主要表現(xiàn)為大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積。病因治療是防治慢性肝損傷的根本措施，但不少慢性肝病目前還缺乏有效的防治手段[2～4]，抑制肝纖維化進(jìn)展是阻斷慢性肝病不良結(jié)局的關(guān)鍵[5，6]。脯氨酰寡肽酶（Prolyl oligopeptidase，POP）是由約 700個氨基酸殘基組成的蛋白[7]，具有酶和非酶雙重功能，體內(nèi)分布廣泛。在大鼠、小鼠與人類之間的同源性極高[8]。POP在肝內(nèi)有較高的活性，存在于肝細(xì)胞和肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞內(nèi)，其水平升高參與促進(jìn)出生后肝臟成熟、肝切除后肝再生等生理過程，同時它是抗肝纖維化內(nèi)源性小分子肽N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸生成的關(guān)鍵酶[9，10]。目前，對于POP是否直接參與肝纖維化調(diào)控尚未見研究報道。由此，本實驗采用慢病毒過表達(dá)技術(shù)過表達(dá)POP，通過門靜脈注射慢病毒入肝臟，對硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型進(jìn)行干預(yù)，初步探究POP對大鼠肝纖維化的影響，為進(jìn)一步以POP為靶點的抗肝纖維化治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SPF級健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200g，由上海普希爾-必凱實驗生物公司提供。Realtime-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、real-timePCR試劑盒均購自Takara公司；慢病毒過表達(dá)載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠Ig G購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；抗POP購自Sigma公司；酸水解法檢測羥脯氨酸（Hyp）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 慢病毒過表達(dá)載體的制備 根據(jù)GenBank提供的大鼠POP基因序列 NM_031324，篩選和構(gòu)建慢病毒POP過表達(dá)載體，通過測序驗證，證實構(gòu)建成功。經(jīng)酶切、電泳及Western Blot檢測驗證，證實POP慢病毒過表達(dá)載體過表達(dá)成功后，進(jìn)行慢病毒大規(guī)模包裝和滴定。

1.3 動物模型制備 取40只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對照組、硫代乙酰胺（TAA）模型組、TAA模型+空病毒組、TAA模型+POP慢病毒過表達(dá)載體組。對正常對照組（n＝10）動物，經(jīng)腹腔注射生理鹽水20mg/100g體質(zhì)量，2次/w；模型組（n＝10）、空病毒組（n＝10）、POP組（n＝10）均給予 5%TAA（溶劑為生理鹽水）20 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射，2次/w，注射1 w，制備肝纖維化模型。造模1 w末，在POP組動物，給予5×107TU POP慢病毒過表達(dá)載體/只門靜脈注射，空病毒組經(jīng)門靜脈注射5×107TU空病毒栽體/只，正常對照組和模型組經(jīng)門靜脈注射等體積生理鹽水100μl，共治療3 w。在治療結(jié)束時（距造模4 w末），正常對照組和POP組各死亡1只大鼠，其余大鼠以2%戊巴比妥鈉8mg.kg-1腹腔注射麻醉，經(jīng)下腔靜脈取血10～15ml，分離血清，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。取出完整肝臟，取1cm×1cm×1cm大小肝組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制備 4μm切片，行 HE、Masson染色，在光鏡下觀察；其余肝組織經(jīng)生理鹽水沖洗后剪成組織塊，放入凍存管中，儲存于-80℃冰箱備用。肝纖維化病理形態(tài)學(xué)分級參照《病毒性肝炎防治方案》[11]，肝組織膠原沉積情況的半定量評分參照2002年肝纖維化療效診斷及評估共識[12]。

1.4 肝組織 POP mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法，按照 Trizol試劑說明提取肝組織總 RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。POP上、下游引物序列分別為5′-AGTGCCGTTTCTTGAGCAGT-3′和 5′-CGTCATCCGACAGAGTGTTG-3′；GAPDH 上、下游引物序列分別為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′和 5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。反應(yīng)體系20μl，設(shè)立2個復(fù)孔，按兩步法擴(kuò)增，預(yù)變性：95℃ 30s；PCR 反應(yīng)：95℃ 5s，60℃ 30s，循環(huán) 40 次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的基因POP mRNA的相對水平，用2-ΔΔCT表示。

1.5 肝組織POP蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法，取肝組織30～40mg。用RIPA蛋白裂解液裂解、勻漿，12000 r/m離心10 min，取蛋白上清分裝于1.5 ml離心管中，采用BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白150μg，行12%SDS-PAGE電泳，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移，加一抗，4℃中孵育過夜，再與HRP偶聯(lián)二抗室溫中孵育1 h，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。采用Image Lab軟件對Westem blot檢測結(jié)果進(jìn)行灰度分析，灰度值代表蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計軟件，計量資料以（）表示。羥脯氨酸含量、POP蛋白灰度值采用單因素方差分析，組間差異采用LSD法進(jìn)行比較；對方差不齊資料（POP的mRNA相對表達(dá)量），采用Kruskal-Wallis H檢驗，等級資料（大鼠的病理分級）采用非參數(shù)秩和檢驗。P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織病理學(xué)改變 正常對照組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯纖維化；模型組和空病毒組肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生，纖維化以II期為主；POP干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，肝纖維化以1期為主，各組纖維化分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表1）。Masson染色顯示，正常對照組僅在匯管區(qū)或血管周圍見少量藍(lán)色陽性沉著；模型組和空病毒組可見除血管和膽管周圍著色外，有藍(lán)色膠原纖維從匯管區(qū)和中央靜脈管壁向肝實質(zhì)細(xì)胞延伸，形成不完全纖維間隔；POP組較模型組纖維沉積程度減輕，纖維間隔短而少（圖1）。對各組進(jìn)行纖維化半定量評分，結(jié)果模型組評分（15.2±1.69）明顯高于正常組[（1.75±0.63），P<0.05）]，POP組（7.75±2.71） 顯著低于空病毒組[（15.3±4.62），P<0.05]。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE和Masson，200×）

2.2 肝組織羥脯氨酸含量比較 與正常對照組羥脯氨酸水平 [（298.20±47.47）μg/g肝質(zhì)量]相比，模型組[（504.47±111.15）μg/g 肝質(zhì)量]和空病毒組[（498.32±90.87）μg/g肝質(zhì)量]均顯著升高，差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；POP組羥脯氨酸水平為 [（383.52±43.49）μg/g肝質(zhì)量]，顯著低于模型組和空病毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖 2）。

表1 各組大鼠肝纖維化病理學(xué)分期

2.3 肝組織POP mRNA和蛋白水平變化 POP組大鼠肝組織POP mRNA水平為正常對照組、模型組和空病毒組的2～5倍（P<0.01），且模型組較正常對照組POP mRNA水平稍有降低（P<0.05）；慢病毒介導(dǎo)的POP過表達(dá)組大鼠肝組織POP相對表達(dá)量明顯高于正常對照組、模型組和空病毒組水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），模型組較正常對照組POP蛋白表達(dá)也有降低（P<0.05，圖 3）。

圖2 各組肝組織羥脯氨酸含量比較 按肝組織濕重對羥脯氨酸含量進(jìn)行標(biāo)化，*:P<0.05

圖3 各組肝組織POP mRNA和蛋白表達(dá)情況

4 討論

本研究結(jié)果顯示，TAA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化時肝內(nèi)POP水平下調(diào)，而攜POP基因慢病毒能成功在大鼠肝組織中顯著提高POP蛋白水平；上調(diào)POP水平能抑制TAA誘導(dǎo)的大鼠肝內(nèi)炎癥，減輕肝內(nèi)纖維組織沉積，降低肝內(nèi)羥脯氨酸，提示POP過表達(dá)阻抑了大鼠纖維化的發(fā)展。

慢性肝損傷時肝臟病理性修復(fù)，其重要特征是細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和肝細(xì)胞增殖不良，導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化[13]。雖然病因治療是防治慢性肝損傷的根本措施[14]，但不少慢性嗜肝病毒感染及非感染性慢性肝病目前還缺乏有效防治手段[15，16]，一些慢性肝病即使病因得以控制，但慢性肝損傷仍然不斷進(jìn)展[16]，因此，認(rèn)識慢性肝損傷后肝臟修復(fù)的機(jī)制和細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)換失衡的原因，仍是目前肝纖維化和肝硬化防治的重要研究方向。

POP是一種存在于肝臟內(nèi)的絲氨酸蛋白酶，能專一水解肽鏈羧基端的脯氨酰鍵，但底物必須為小于30氨基酸殘基的小分子多肽和胺類等小分子物質(zhì)[17，18]。POP在肝內(nèi)的生理功能目前認(rèn)識有限，早年研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟，POP較均衡地分布于肝細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)，而肝細(xì)胞與庫普弗細(xì)胞均是肝損傷修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠部分肝切除后，肝內(nèi)源性POP活性在術(shù)后2天達(dá)到最大，術(shù)后9天逐漸降至正常組水平，這種活性變化與肝再生水平相關(guān)；而抑制POP活性水平后，肝細(xì)胞增殖被顯著抑制[20]。與此相似，另有二項研究發(fā)現(xiàn)POP促進(jìn)肝臟的生理性發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，新生小鼠肝臟內(nèi)POP活性逐漸升高并在出生第8天出現(xiàn)峰值，而且這種活性變化與新生小鼠肝臟內(nèi)肝細(xì)胞增殖和分化水平相平行[21，22]。以上研究結(jié)果均提示POP在調(diào)控肝內(nèi)微環(huán)境、促進(jìn)肝細(xì)胞增殖與分化中起關(guān)鍵作用，POP可能是調(diào)控肝損傷后肝組織生理性修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，在肝臟病理性修復(fù)中發(fā)揮重要作用[23]。

支持這一推測的最早研究結(jié)果是發(fā)現(xiàn)慢性肝損傷肝纖維化過程中存在POP水平下調(diào)的情況，這提示可能POP直接或間接（通過下調(diào)N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸）參與肝纖維化的發(fā)生，然而這些研究未能提供直接實驗依據(jù)證實這一推測。在本研究中也觀察到POP水平在TAA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化階段有顯著下調(diào)，并進(jìn)一步通過慢病毒介導(dǎo)成功實現(xiàn)在肝組織中過表達(dá)POP蛋白，通過提高POP蛋白水平，觀察提高POP水平后對TAA誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的直接影響。研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)POP蛋白后，大鼠肝臟炎癥、肝纖維化分級、肝內(nèi)羥脯氨酸含量等均較模型組顯著改善，提示POP能直接抑制慢性肝損傷后肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

POP抑制TAA誘導(dǎo)肝纖維化的機(jī)制本研究并未能明確。我們推測這一作用可能與促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、炎癥抑制和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)沉積均相關(guān)。如前所述，POP是肝損傷后肝細(xì)胞增殖的重要促進(jìn)蛋白，提高肝內(nèi)POP水平可能有助于肝細(xì)胞增殖與分化。此外，肝內(nèi)巨噬細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞是肝纖維化時肝內(nèi)炎癥和肝細(xì)胞增殖的重要介導(dǎo)細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB激活是肝細(xì)胞增殖的啟動因子[24]，而POP大量表達(dá)于肝內(nèi)巨噬細(xì)胞胞質(zhì)與胞核內(nèi)[25]，還與增殖中的肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性密切相關(guān)，且可通過N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸抑制炎性反應(yīng)，通過調(diào)控胸腺素β4影響肝內(nèi)細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞胞吞、趨化、分泌等[26]。在慢性肝損傷過程中，除POP蛋白表達(dá)下調(diào)外，還可能存在POP功能的抑制，例如炎性反應(yīng)時局部浸潤的炎性細(xì)胞可通過分泌蛋白酶抑制劑等直接抑制POP功能[27]。以上研究說明，POP可通過影響肝內(nèi)巨噬細(xì)胞功能、NF-κB活性、胸腺素β4與N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸水平等，主導(dǎo)肝損傷修復(fù)微環(huán)境的調(diào)控，其自身亦受炎性活動的負(fù)反饋調(diào)控。上調(diào)POP水平，可能有助于促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、抑制巨噬細(xì)胞功能和過度炎癥反應(yīng)、調(diào)控N-乙酰基-絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸水平影響炎癥與肝星狀細(xì)胞功能等。具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究加以證實。

肝纖維化不但病因復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制也亟待明確。本研究證實過表達(dá)POP能抑制TAA誘導(dǎo)大鼠肝纖維化后，需要進(jìn)一步的研究來明確其作用機(jī)制、方式與靶細(xì)胞等一系列問題，以及其在其它病因介導(dǎo)的肝纖維化中的可能作用。通過完成這一系列后續(xù)研究，有望進(jìn)一步了解肝纖維化的機(jī)制，為其防治提供理論基礎(chǔ)。

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