呂心瑞，王保芳，王葆輝，徐曉，陳明亮△(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，開(kāi)封市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南開(kāi)封475004)

·短篇論著·

MCPH1在電離輻射誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞DNA損傷通路中的作用*

呂心瑞1，王保芳1，王葆輝2，徐曉1，陳明亮1△
(1河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，2開(kāi)封市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南開(kāi)封475004)

目的:研究MCPH1在電離輻射誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞DNA損傷通路中的作用。方法:應(yīng)用已構(gòu)建的沉默MDC1的食管癌ECA109細(xì)胞株接受8 Gy電離輻射后1 h，檢測(cè)相關(guān)因子核內(nèi)斑點(diǎn)形成情況。構(gòu)建沉默MCPH1的食管癌ECA109細(xì)胞株，檢測(cè)此細(xì)胞株接受同樣照射條件后相關(guān)因子核內(nèi)斑點(diǎn)的形成情況。結(jié)果:成功構(gòu)建沉默MCPH1的食管癌ECA109細(xì)胞;電離輻射使MDC1、MCPH1與γ-H2AX蛋白相互作用。沉默MDC1不影響γ-H2AX和MCPH1核內(nèi)斑點(diǎn)的形成;沉默MCPH1使電離輻射導(dǎo)致的MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)減少，不影響γ-H2AX核內(nèi)斑點(diǎn)的形成。結(jié)論:MCPH1在電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷通路中可能位于H2AX下游、MDC1上游，可以調(diào)控MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)形成。

MCPH1;電離輻射;MDC1;DNA雙鏈損傷

［ABSTRACT］AIM:To discover the effectofMCPH1 on the DNA damage induced by ionizing radiation in esophageal cancer cells.METHODS:ECA109 cancer cells were radiated at dose of8 Gy.The nuclear foci of relevant factors were detected 1 h after irradiation in the ECA109 cells after silence of MDC1 gene.A cell linewas established thatwas stable low expression of MCPH1.The nuclear foci induced by ionizing radiation after silence of MCPH1 were determined.RESULTS:The MCPH1 gene silenced ECA109 cell line was successfully constructed.A strong relationship between MDC1，MCPH1 andγ-H2AX was observed 1 h after 8 Gy irradiation.Silence of MDC1 did not affect the nuclear foci formation of γ-H2AX and MCPH1.The nuclear fociof MDC1 but notγ-H2AX significantly reduced after silencing of MCPH1.CONCLUSION:MCPH1 is located in the downstream of H2AX and upstream formation ofMDC1，and regulates the nuclear foci formation of MDC1 during DNA damage response.

［KEY WORDS］MCPH1;Irradiation;MDC1;DNA double-strand breaks

MCPH1基因位于8號(hào)染色體短臂2區(qū)3帶(8p23)上，共編碼835個(gè)氨基酸，具有3個(gè)功能域。MCPH1蛋白參與細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及染色體凝集過(guò)程，并參與細(xì)胞分裂的全過(guò)程［1］。最初是在小頭畸形(microcephalia，MCPH)的病人中發(fā)現(xiàn)MCPH1基因變異?，F(xiàn)在有觀點(diǎn)認(rèn)為MCPH1參與的損傷應(yīng)答通路與乳腺癌的診斷、預(yù)后相關(guān)［2］。H2AX是電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷通路中的最重要和最早反應(yīng)的蛋白，它的磷酸化現(xiàn)象——形成γ-H2AX被認(rèn)為是DNA雙鏈損傷的信號(hào)燈，并且聚集于DNA雙鏈損傷位點(diǎn)，其它的調(diào)節(jié)蛋白如MDC1、53BP1接到信號(hào)后，陸續(xù)募集于相同的位置［3-5］。食管癌細(xì)胞接受電離輻射后可引起細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)如Wnt通路下游基因的磷酸化發(fā)生改變［6］。前期的研究顯示MCPH1與MDC1均參與電離輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈損傷，電離輻射可以誘導(dǎo)它們核內(nèi)斑點(diǎn)形成，并且這一現(xiàn)象受H2AX基因調(diào)控［7］。那么MCPH1與MDC1的關(guān)系是什么，它們之間存在相互調(diào)控關(guān)系嗎?本研究主要利用小干擾RNA技術(shù)以及共聚焦顯微鏡方法觀察兩者核內(nèi)斑點(diǎn)表達(dá)情況，檢測(cè)兩者之間的上下游關(guān)系。

材料和方法

1細(xì)胞株與試劑

食管癌ECA109細(xì)胞株購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司;兔抗人H2AX多克隆抗體及兔抗人γ-H2AX多克隆抗體購(gòu)自Bioworld;兔抗人MCPH1單克隆抗體及兔抗人MDC1單克隆抗體購(gòu)自Abcam。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞照射細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于玻璃培養(yǎng)瓶，加入含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。西門(mén)子直線加速器6MV-X射線照射，照射面積為20 cm×20 cm，源皮距100 cm，機(jī)架角180度，室溫條件下分別照射沉默MDC1、MCPH1前后的ECA109細(xì)胞，照射劑量為8 Gy。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默MDC1的食管癌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自行轉(zhuǎn)染沉默。沉默MCPH1的病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P公司，用空病毒載體和沉默MCPH1的病毒載體轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞，用嘌呤霉素藥物篩選，篩選72 h后熒光下顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

2.3用RT-PCR法檢測(cè)沉默MCPH1前后ECA109細(xì)胞中MCPH1 mRNA水平采用Trizol一步法從不同實(shí)驗(yàn)組的ECA109細(xì)胞中提取總RNA，取等量RNA加入無(wú)核酸酶微量離心管，加入OligodT，70℃水浴孵育10 min，置于冰上5 min使RNA變性，然后分別加入10×RT反應(yīng)緩沖液0.1 mol/L DTT RNA酶抑制劑及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃孵育2 h合成cDNA，置于94℃干浴器上加熱5 min終止反應(yīng)。取1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為反應(yīng)模板，分別加入dNTP、10×PCR反應(yīng)緩沖液、MCPH1或GAPDH上下游引物、Taq DNA聚合酶，加無(wú)菌水至總體積20μL，置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，掃描成像。

2.4用Western blotting檢測(cè)沉默MCPH1前后ECA109細(xì)胞中MCPH1的蛋白水平收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞懸于RIPA細(xì)胞裂解液中，收集上清，用改良的Lowry法進(jìn)行蛋白定量。灌制10%分離膠和5%濃縮膠。取等量蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃水浴加熱5 min使蛋白充分變性。用微量加樣器將樣品加入到凝膠加樣孔內(nèi)。電泳后，取出凝膠，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，然后取PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h。將封閉后的PVDF膜置入用TTBS以適當(dāng)比例稀釋的I抗溶液中，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。取出PVDF膜放入盛有適量TTBS平皿中，室溫洗膜，然后將PVDF膜置入用TTBS 1∶20 000稀釋的IRDye800CW熒光標(biāo)記II抗溶液中，室溫反應(yīng)1 h。取出PVDF膜放入盛有適量TTBS平皿中，室溫洗膜后用Odyssey發(fā)光儀檢測(cè)抗體結(jié)合條帶。

2.5免疫共沉淀法檢測(cè)MDC1、MCPH1與γ-H2AX蛋白的表達(dá)情況分組提取蛋白后，建立250μL體系，每個(gè)體系中包括按照80μg計(jì)算的蛋白體積;3 μLγ-H2AX(MDC1、MCPH1、H2AX、IgG)兔抗體; 2.5μL PMSF，剩下的用IPH補(bǔ)足250μL，IgG為陰性對(duì)照用;將上述體系置于4℃搖床1 h;加protein A珠子20μL/管，搖床過(guò)夜;于4℃、12 000 r/min離心3 min，棄部分上清，加入400μL IPH，4℃搖床振蕩20 min;前一過(guò)程重復(fù)4遍;于4℃、12 000 r/min離心3 min，棄盡可能多的上清，加入10～15μL 2× buffer，用手輕彈混勻，煮沸5 min;常溫、12 000 r/min離心1 min;按照Western blotting的方法檢測(cè)8 Gy照射后1 h時(shí)γ-H2AX、H2AX、MDC1、MCPH1及IgG的蛋白表達(dá)情況。

2.6免疫熒光檢測(cè)核內(nèi)斑點(diǎn)照射后1 h檢測(cè)MDC1、MCPH1與γ-H2AX核內(nèi)斑點(diǎn)的情況，按照免疫熒光方法，激光共聚焦顯微鏡顯像觀察。將上述細(xì)胞加3%H2O2室溫孵育30 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性;多聚甲醛固定15～20 min;0.5% Triton破膜10min×2次;滴加正常山羊血清封閉液，室溫60 min;滴加適當(dāng)稀釋的兔抗人單克隆抗體(MDC1、MCPH1和γ-H2AX均為1∶100稀釋)，空白對(duì)照不加I抗，用PBS代替，室溫孵育2 h;避光加入DAPI稀釋(1∶2 000)的CY3標(biāo)記的熒光II抗，37℃溫箱、濕盒內(nèi)孵育60 min，此后的所有操作步驟均為避光進(jìn)行。水溶性封片劑封片(甘油∶PBS為3∶1)，激光共聚焦顯微鏡調(diào)至油鏡下觀察。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 11.7統(tǒng)計(jì)軟件，多組均數(shù)的比較用單因素方差分析，方差分析的組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1在mRNA水平檢測(cè)沉默MCPH1基因的效果

在mRNA水平上沉默組與空白組比較，MCPH1的沉默效果顯著(P＜0.05);空白組與空載體組無(wú)明顯差異，即病毒載體對(duì)基因轉(zhuǎn)錄無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖1。

Figure 1.ThemRNA expression of MCPH1 after silencing.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖1　m RNA水平檢測(cè)MCPH1的沉默效果

2在蛋白水平檢測(cè)沉默MCPH1基因的效果

在蛋白水平上沉默組與空白組相比，MCPH1的沉默效果顯著(P＜0.05);而空白組與空載體組無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

3免疫共沉淀顯示照射前后相關(guān)蛋白表達(dá)情況

照射前MDC1、MCPH1與γ-H2AX蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯相關(guān)性，照射后1 h，MDC1、MCPH1與γ-H2AX蛋白之間發(fā)生明顯的相互作用，見(jiàn)圖3。

4應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)沉默MDC1對(duì)相關(guān)因子核內(nèi)斑點(diǎn)的影響

電離輻射可以使γ-H2AX、MDC1和MCPH1核內(nèi)斑點(diǎn)增加;沉默MDC1使MDC1的核內(nèi)斑點(diǎn)減少，并不影響電離輻射導(dǎo)致的γ-H2AX與MCPH1核內(nèi)斑點(diǎn)的形成，MCPH1核內(nèi)斑點(diǎn)略有減少，差別不顯著(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

5沉默MCPH1對(duì)相關(guān)因子核內(nèi)斑點(diǎn)的影響

沉默MCPH1基因不僅可使電離輻射導(dǎo)致的MCPH1核內(nèi)斑點(diǎn)減少，同時(shí)可以顯著減少M(fèi)DC1核內(nèi)斑點(diǎn)的形成(P＜0.05);但是沉默MCPH1基因并不影響γ-H2AX核內(nèi)斑點(diǎn)的形成，見(jiàn)圖5。

Figure 3.Themethod of Co-IP was used to detect the relationship between MDC1，MCPH1 andγ-H2AX 1 h after8 Gy irradiation.1～5 and 1’～5’represent the proteins of H2AX，MDC1，MCPH1，γ-H2AX and IgG before and after irradiation.圖3　免疫共沉淀法顯示電離輻射前后MDC1、MCPH1與γ-H2AX蛋白表達(dá)情況

Figure 4.The changes of nuclear fociof the relevant factors after silencing of MDC1.1～4 represent control group，irradiated group，silence group and silence+irradiation group，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs1;△P＜0.05 vs3.圖4　沉默MDC1后相關(guān)因子核內(nèi)斑點(diǎn)的變化

Figure 5.The changes of nuclear foci of the relevant factors after silencing of MCPH1.1～4 represents control group，irradiated group，silence group and silence+irradiation group，respectirely.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs1;△P＜0.05 vs3.圖5　沉默MCPH1后相關(guān)因子核內(nèi)斑點(diǎn)的變化

討論

研究顯示電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中最重要的就是DNA雙鏈損傷，而H2AX磷酸化對(duì)DNA損傷后的MCPH1斑點(diǎn)形成起著舉足輕重的作用，我們?cè)谇捌诘难芯恐凶C實(shí)，H2AX磷酸化是DNA雙鏈損傷的標(biāo)志，H2AX磷酸化形成γ-H2AX，一些調(diào)節(jié)器如MDC1、53BP1聚集到DNA損傷位點(diǎn)，與γ-H2AX相互作用，形成核內(nèi)斑點(diǎn)，通過(guò)ATM通路調(diào)節(jié)下游的CHK2等因子。而近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的MCPH1也位于H2AX下游，電離輻射導(dǎo)致的MCPH1核內(nèi)斑點(diǎn)形成依賴(lài)H2AX磷酸化即γ-H2AX［7-8］。那么MCPH1與MDC1是什么關(guān)系?它們之間是否存在相互調(diào)控關(guān)系至今仍不清楚。一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)檢測(cè)了應(yīng)用siRNA技術(shù)敲低MCPH1后DNA損傷的情況［9-12］，包括從細(xì)胞周期檢測(cè)缺陷到斑點(diǎn)形成消失，主要是由于DNA損傷應(yīng)答中一些重要的調(diào)節(jié)器和效應(yīng)器蛋白之間不能相互作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期中正常的G2/M期無(wú)法順利轉(zhuǎn)換。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電離輻射導(dǎo)致了γ-H2AX與MCPH1及MDC1非常明顯的相互作用，這種相互作用在未照射時(shí)是不存在的。為了解MCPH1在DNA損傷通路中的具體位置及調(diào)控因素，我們照射沉默MDC1的食管癌細(xì)胞，結(jié)果顯示MCPH1斑點(diǎn)形成并不依賴(lài)MDC1，這一結(jié)果與Jamie等［13］的報(bào)道相似，他認(rèn)為MCPH1在電離輻射后形成的斑點(diǎn)并不依賴(lài)一些調(diào)節(jié)器蛋白，如MDC1、53BP1和BRCA1。而照射沉默MCPH1基因的食管癌細(xì)胞可以減少M(fèi)DC1斑點(diǎn)的形成，這就說(shuō)明MCPH1在DNA損傷誘導(dǎo)通路中扮演了一個(gè)在初期就起作用的角色，它只受H2AX磷酸化過(guò)程調(diào)控。MDC1已被證實(shí)在DNA損傷檢測(cè)通路中是一個(gè)調(diào)節(jié)器，負(fù)責(zé)包括NBS1、53BP1、BRCA1在內(nèi)的許多監(jiān)測(cè)點(diǎn)蛋白的募集反應(yīng)［14-16］，并促進(jìn)更多H2AX于DNA損傷位點(diǎn)磷酸化，來(lái)擴(kuò)大DNA損傷信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)［17］。那么MCPH1位于MDC1的上游，它直接影響了MDC1核內(nèi)斑點(diǎn)的形成，沉默MCPH1后一方面減弱MCPH1在DNA損傷通路中的作用，并且必然使其下游的MDC1作用削弱，從而影響DNA損傷傳導(dǎo)通路的完整。能否通過(guò)影響這一通路調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞放射敏感性是我們下一研究的重點(diǎn)。

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Effect of MCPH1 on irradiation induced DNA damage in esophageal cancer cells

LüXin-rui1，WANG Bao-fang1，WANG Bao-hui2，XU Xiao1，CHEN Ming-liang1
(1Department of Physiology，Medical College of Henan University，2Department of Neurology，Kaifeng Children Hospital，Kaifeng 475004，China.E-mail:chml163@163.com)

R363.1+21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.027

1000-4718(2015)05-0924-05

2014-11-17［修回日期］2015-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.U1404310);河南大學(xué)博士啟動(dòng)基金(No.B2013043)

Tel:0371-23885855;E-mail:chml163@163.com