何靜宇，雷正明，溫劍，付文廣(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000;巴中市中心醫(yī)院肝膽外科，四川巴中636000)

瘦素對HepG2細胞中BSEP蛋白表達及信號通路的影響

何靜宇1，2，雷正明1△，溫劍1，付文廣1
(1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州646000;2巴中市中心醫(yī)院肝膽外科，四川巴中636000)

目的:探討瘦素(leptin)對人肝癌細胞(HepG2)膽鹽輸出泵(bile saltexport pump，BSEP)蛋白表達及信號通路的影響。方法:體外培養(yǎng)HepG2細胞，不同瘦素濃度(10－8、10－7和10－6mol/L)作為刺激因子，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用Western blotting法檢測HepG2細胞的AMPKa、BSEP蛋白表達及AMPKa磷酸化(p-AMPKa)水平;篩選BSEP蛋白表達的最佳培養(yǎng)時間及瘦素濃度點，加入10μmol/L AMPK阻斷劑compound C進行細胞培養(yǎng)，用Western blotting法檢測BSEP蛋白表達。結果:(1)不同濃度瘦素干預HepG2細胞72 h時，隨瘦素濃度增高AMPKa蛋白表達量逐漸增高，在瘦素濃度為10－6mol/L時AMPKa蛋白表達最強(P＜0.01);(2)不同濃度瘦素干預HepG2細胞24 h后，AMPKa磷酸化水平與瘦素濃度呈劑量依賴逐漸增強(P＜0.01)，相同瘦素濃度組AMPKa磷酸化水平隨時間逐漸增加(P＜0.01);(3)不同濃度瘦素干預HepG2細胞24 h后，BSEP蛋白表達水平與瘦素濃度呈劑量依賴逐漸增強(P＜0.01)，相同瘦素濃度組BSEP蛋白表達量隨時間逐漸增加(P＜0.01);(4)72 h測得10－6mol/L瘦素組和10－6mol/L瘦素+10μmol/L compound C組BSEP蛋白表達較正常對照組均增加(P＜0.01)，compound C可降低BSEP蛋白的表達(P＜0.01)。結論:瘦素可通過“l(fā)eptin-AMPK-BSEP”途徑促進HepG2細胞BSEP蛋白表達;瘦素可促進HepG2細胞AMPKa蛋白表達及AMPKa磷酸化水平。

肝內膽管結石病;瘦素;膽鹽輸出泵;腺苷酸活化蛋白激酶

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effects of leptin on the expression of bile salt export pump(BSEP)and signaling pathway in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2.METHODS:HepG2 cells were cultured in vitro.Leptin at concentrations of 10－8，10－7and 10－6mol/L was used as a stimulating factor.The protein levels of adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha subunit(AMPKa)，phosphorylated AMPKa(p-AMPKa)and BSEP in the HepG2 cells at24 h，48 h and 72 h were detected by Western blotting.The optimal culture time and leptin concentration were selected，and compound C at concentration of 10μmol/L was added to this group.The protein expression of BSEP was detected by Western blotting.RESULTS:Intervention of HepG2 cells with leptin for 72 h increased the protein expression of AMPKa gradually in a concentration-dependentmanner，and leptin at concentration of 10－6mol/L induced the strongest AMPKa expression(P＜0.01).Intervention of HepG2 cells with leptin for 24 h increased the phosphorylation level of AMPKa gradually in a dose-dependentmanner(P＜0.01).The effect of leptin on the increase in the protein expression of p-AMPKa was also in a time-dependentmanner(P＜0.01).After intervention with different concentrations of leptin for 24 h，the protein expression of BSEP in the HepG2 cellswas gradually increased by the stimulation of leptin in a concentration-and time-dependentmanner(P＜0.01).Compared with NC group，the protein expression of BSEP in 10－6mol/L leptin group and 10－6mol/L leptin+10μmol/L compound C group was increased at72 h(P＜0.01)，and that in 10－6mol/L leptin+10μmol/L compound C group was lower than that in 10－6mol/L leptin group at72 h(P＜0.01).CONCLUSION:Leptin promotes the protein expression of BSEP in HepG2 cells by leptin-AMPK-BSEP signaling pathway.Leptin promotes the increases in AMPKa protein and the level of phosphorylation of AMPKa in HepG2 cells.

［KEY WORDS］Hepatolithiasis;Leptin;Bile salt export pump;Adenosinemonophosphate-activated protein kinase

原發(fā)性肝膽管結石(hepatolithiasis，HS)主要是膽紅素鈣結石，其發(fā)生呈明顯地域性分布，好發(fā)于東方國家如中國、日本、韓國等(占同期住院膽石癥病人中的構成比4%～52%)，西方發(fā)達國家少見(占同期住院膽石癥病人中的構成比0.9%～1.3%)［1］。在我國1994年全國膽石病調查中肝膽管結石病例在住院膽石癥病人中的構成比為4.7%，較1983～1985年的16.1%有明顯下降［2］，術后殘石率高、復發(fā)率高、再次手術率高并可導致嚴重并發(fā)癥，仍是當今治療難題。HS的發(fā)病機制可能與機體營養(yǎng)狀況、膽道感染、膽道狹窄、膽汁代謝、成分失衡等因素有關，但確切發(fā)病機制尚不明確。研究顯示膽汁中膽汁酸濃度在肝膽管結石組較正常對照組明顯降低［3］，說明膽汁酸可能在HS的形成中起重要作用。瘦素(leptin)作為腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)活化的上游因子之一，在機體能量代謝及調控等多方面起重要作用［4］。在我們前期研究中證明瘦素可能在肝膽管結石形成中起重要作用［5］。近來研究［6］表明AMPK可調控膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP)蛋白的表達，而BSEP是將肝細胞內膽汁酸泵入膽小管的重要通道，可調控膽道膽汁酸的濃度;研究表明，BSEP基因突變的個體對膽石病有易感性［7］。臨床中常用的溶石藥物是熊去氧膽酸，實驗證明其可刺激患者肝臟中BSEP的表達［8］。因此，本課題將探討瘦素對HepG2細胞BSEP蛋白表達的影響及作用機制，進一步從代謝途徑闡述HS的發(fā)病機制并可能為肝膽管結石提供新的治療方案。

材料和方法

1材料與試劑

人肝癌細胞HepG2購自上海博谷生物科技有限公司;兔抗人AMPKa多克隆抗體和兔抗人phospho-AMPKa(Thr172)多克隆抗體購自CST;山羊抗人BSEP多克隆抗體購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標記小鼠抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記小鼠抗山羊IgG購自碧云天生物技術研究所;瘦素多肽購自北京博奧森生物技術有限公司;AMPK阻斷劑compound C購自Sigma。

2細胞培養(yǎng)和實驗分組

用RPMI-1640培養(yǎng)基對HepG2細胞進行細胞培養(yǎng)，用不同濃度(10－6、10－7和10－8mol/L)的瘦素干預，分別于24 h、48 h、72 h時提取蛋白置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆?待測出BSEP蛋白表達最強的時間及濃度點，以該濃度leptin+10μmol/L AMPK阻斷劑Compound C進行細胞培養(yǎng)后提取蛋白。

實驗分為正常對照組(NC組:培養(yǎng)基不含leptin)，10－8mol/L leptin組(培養(yǎng)基含10－8mol/L leptin)，10－7mol/L leptin組(培養(yǎng)基含10－7mol/L leptin)，10－6mol/L leptin組(培養(yǎng)基含10－6mol/L leptin)，將各組分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后用Western blot檢測BSEP蛋白水平，比較不同時間及l(fā)eptin刺激點，將BSEP表達最強點作為leptin+AMPK阻斷劑組(培養(yǎng)基含10－6mol/L leptin+10μmol/L AMPK阻斷劑compound C)。

3Western blotting檢測AM PKa及BSEP蛋白的表達及AMPKa磷酸化水平

取等量蛋白與相應的蛋白加樣緩沖液進行還原變性的10%SDS-PAGE，半干轉儀(Bio-Rad)將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，室溫下封閉3 h，TBST液漂洗10 min 3次，加入兔抗人AMPKa多克隆抗體(1∶600)、兔抗人phospho-AMPKa(Thr172)多克隆抗體(1∶500)、山羊抗人BSEP多克隆抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，經(jīng)過TBST液嚴格漂洗后，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔II抗(1∶2 000)孵育1 h，再將膜用TBST液徹底漂洗(10 min 3次)后進行ECL化學發(fā)光顯影。結果用凝膠攝像分析系統(tǒng)Bio-Rad掃描入計算機中，Quantity One凝膠定量分析軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與β-actin條帶的灰度值比值作為蛋白相對表達量，以相對灰度值分析各組之間的差異性。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1瘦素對HepG2細胞AMPKa蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，不同濃度瘦素干預HepG2細胞24 h及48 h，AMPKa蛋白的表達量無明顯變化(P＞0.05)，但在72 h時，隨瘦素濃度增高，AMPKa蛋白的表達量逐漸增高，在瘦素濃度為10－6mol/L時AMPKa蛋白表達最強，同NC組、48 h時10－6mol/L leptin組和72 h時10－7mol/L leptin組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The protein expression of AMPKa detected by Western blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs 10－7mol/L leptin group at72 h.圖1　不同瘦素濃度分別作用24 h、48 h及72 h后AMPKa的蛋白表達

2瘦素作用對HepG2細胞p-AMPKa蛋白水平的影響

Western blotting結果顯示，24 h測得各組p-AMPK的蛋白水平組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);48 h后AMPKa的磷酸化水平呈時間和劑量依賴逐漸增強，72 h時同NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24 h、48 h和72 h時相同瘦素濃度組p-AMPKa蛋白水平逐漸增加，72 h時10－6mol/L leptin組同24 h、48 h的10－6mol/L leptin組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein expression of p-AMPKa detected byWestern blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs10－7mol/L leptin group at72 h.圖2　不同瘦素濃度分別作用24 h、48 h及72 h后p-AMPKa的蛋白表達

3瘦素對HepG2細胞中BSEP蛋白表達的影響

24h測得各組BSEP蛋白表達量組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);48 h后BSEP蛋白的表達量逐漸增加，48 h時10－6mol/L leptin組及72 h組同NC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);24 h、48 h和72 h時相同瘦素濃度組的BSEP蛋白表達量逐漸增加，72 h時10－6mol/L leptin組同24 h和48 h的10－6mol/L leptin組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effects of leptin on the protein expression of BSEP detected byWestern blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs10－7mol/L leptin group at72 h.圖3　不同瘦素濃度分別作用24 h、48 h及72 h后BSEP的蛋白表達

4AMPK阻斷劑com pund C對HepG2細胞BSEP蛋白表達的影響

72 h測得10－6mol/L leptin組和10－6mol/L leptin+10μmol/L compound C組的BSEP蛋白表達較NC組均增加(P＜0.05)，10－6mol/L leptin+10 μmol/L compound C組的BSEP蛋白表達較10－6mol/L leptin組降低(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.Effects of AMPK inhibitor compound C on leptin-induced the protein expression of BSEP detected by Western blotting.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs10－6mol/L leptin group.圖4　AMPK阻斷劑com pound C對10－6mol/L瘦素作用的BSEP蛋白表達的影響

討論

瘦素是一種ob基因編碼、主要由白色脂肪細胞合成和分泌，由146個氨基酸組成4條反向平行α鏈連接而成的激素，可減少進食和促進能量消耗在維持能量平衡中起重要作用［9］;其數(shù)量和脂肪細胞含量成正比，血清中游離瘦素能將外周能量信號傳遞至大腦中樞，調節(jié)進食和能量消耗從而維持能量平衡［10］;瘦素也有廣泛的外周功能，如激活神經(jīng)內分泌、促進血管生成和骨形成、調節(jié)免疫系統(tǒng)、參與腫瘤形成［11］、肝細胞保護［12］、上調膽固醇7α-羥化酶(膽汁酸合成關鍵酶)活性［13］及促進蛋白質合成等多種生物學功能。

人類BSEP(ABCB11)同P-糖蛋白(P-glycoprotein)、多藥耐藥基因3(multidrug resistance 3，MDR-3)一起均屬于ATP結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC transporter)家族MDR/TAP亞家族成員，由ABCB11基因編碼，位于2號染色體長臂(2q24)，BSEP為含1 321個氨基酸、分子量約160 kD、12個跨膜單環(huán)和2個較大核苷酸結合區(qū)域構成蛋白，并只在肝細胞小管膜側表達;BSEP蛋白的表達主要受farnesoid X receptor(FXR)、liver receptor homolog 1(Lrh1)和nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)調控［14-15］。人體BSEP是肝細胞膽鹽轉運至膽小管的必須通道，研究表明，ABCB11基因突變的個體顯示出嚴重的肝內膽汁淤積，并且膽汁中膽汁酸濃度明顯降低［13］;BSEP亦能轉運某些復合物如長春堿、紫杉醇和鈣黃綠素等［16］。人類BSEP結構或功能異常后可發(fā)展為嚴重的肝臟疾病如進展型家族性肝內膽汁淤積2型、良性復發(fā)性肝內膽汁淤積、妊娠期肝內膽汁淤積、肝細胞癌［17］及膽石癥［7，16］等。因此，促進BSEP蛋白的表達，可為其導致的相關疾病找到新的治療方法。Chopra等［6］報道AMPK可通過“AMPK-SRC2-FXR-BSEP”信號通路調控BSEP蛋白表達。雖然瘦素可激活肝臟中AMPK活性，且AMPK促進BSEP蛋白表達，但瘦素是否影響B(tài)SEP蛋白合成，是否通過“l(fā)eptin-AMPK-SRC2-FXR-BSEP”通路影響B(tài)SEP蛋白表達目前尚無相關研究。本實驗將HepG2細胞進行體外培養(yǎng)，用不同濃度的瘦素干預(培養(yǎng)基含10－8、10－7和10－6mol/L leptin)，分別于24 h、48 h、72 h用Western blot法檢測AMPKa、p-AMPKa及BSEP蛋白水平，以了解瘦素對BSEP蛋白表達的影響。在瘦素對BSEP蛋白表達刺激最強時間(72 h)和濃度(10－6mol/L)的條件下加入AMPK阻斷劑Compound C后用Western blotting法檢測BSEP蛋白的水平，以說明瘦素是否通過“l(fā)eptin-AMPK-BSEP”通路影響B(tài)SEP蛋白表達。結果顯示在瘦素干預HepG2細胞后雖然AMPKa的變化趨勢不明顯，但其活化形式p-AMPKa同BSEP有相似的變化趨勢;10－6mol/L leptin組和10－6mol/L瘦素+10μmol/L Compound C組BSEP蛋白表達水平較正常組均有所升高，但10－6mol/L leptin+10 μmol/L Compound C組較10－6mol/L leptin組明顯降低，且10－6mol/L瘦素+10μmol/L Compound C組較NC組的BSEP蛋白表達有所升高，提示瘦素主要通過“l(fā)eptin-AMPK-BSEP”通路促進HepG2細胞的BSEP蛋白表達，但是否存在其它調節(jié)HepG2細胞表達BSEP蛋白的通路，有待進一步探討。綜上所述，瘦素可能通過“l(fā)eptin-AMPK-SRC2-FXR-BSEP”信號通路促進HepG2細胞的BSEP蛋白表達，可為HS的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)和新的治療途徑。

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Effects of leptin on BSEP protein expression and signaling pathway in HepG2 cells

HE Jing-yu1，2，LEIZheng-ming1，WEN Jian1，F(xiàn)UWen-guang1
(1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China;2Department of Hepatobiliary Surgery，Central Hospital of Bazhong City，Bazhong 636000，China.E-mail:leizhm@medmail.com.cn)

R730.23;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.019

1000-4718(2015)05-0877-05

2014-10-22

2015-01-23

Tel:0830-3165903;E-mail:leizhm@medmail.com.cn