胡陽，楊杰，余汝媛，汪洋(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，功能蛋白質(zhì)研究廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定PTPLAD1調(diào)控的結(jié)腸癌細(xì)胞酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)*

胡陽，楊杰，余汝媛，汪洋△
(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，功能蛋白質(zhì)研究廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

目的:用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的方法鑒定并分析結(jié)腸癌細(xì)胞中含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結(jié)構(gòu)域蛋白1(PTPLAD1)調(diào)控的酪氨酸磷酸化蛋白。方法:運(yùn)用siRNA技術(shù)沉默PTPLAD1的表達(dá)，于細(xì)胞培養(yǎng)條件下運(yùn)用氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable lsotope labelingwith amino acids in cell culture，SILAC)標(biāo)記細(xì)胞，用酪氨酸磷酸化抗體免疫沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白，用LTQ-OrbitrapXL質(zhì)譜鑒定因敲低PTPLAD1所出現(xiàn)的差異表達(dá)的酪氨酸磷酸化蛋白，進(jìn)一步利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟件對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果:用real-time PCR篩選得到有效的siRNA干擾片段，Western blot驗(yàn)證其干擾效果及有效干擾時(shí)間。質(zhì)譜鑒定PTPLAD1調(diào)控的差異酪氨酸磷酸化蛋白共20個(gè)，其中顯著上調(diào)的8個(gè)，顯著下調(diào)的10個(gè)，主要為轉(zhuǎn)錄因子及腫瘤標(biāo)志物相關(guān)蛋白。IPA軟件的結(jié)果表明PTPLAD1調(diào)控的差異酪氨酸磷酸化蛋白的功能主要與器官發(fā)育分化、維持組織分化類型及細(xì)胞凋亡、增殖相關(guān)。結(jié)論:成功鑒定出PTPLAD1調(diào)控的差異酪氨酸磷酸化蛋白，可以為后續(xù)研究PTPLAD1在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)理提供基礎(chǔ)。

含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結(jié)構(gòu)域蛋白1;HCT-116細(xì)胞;小干擾RNA;氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù);磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)

［ABSTRACT］AIM:To identify and analyze tyrosine-phosphorylated proteins regulated by protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1(PTPLAD1)in colon cancer cells by phosphoproteomics.METHODS:The expression of PTPLAD1 in colon cancer cell line HCT-116 was knocked down by small interfering RNAs，and the differential expression of tyrosine-phosphorylated proteins in response to the konckdown of PTPLAD1 in HCT-116 cellswas identified by stable isotope labeling with amino acid in cell culture(SILAC)，coupled with the tyrosine phosphorylation antibody immunoprecipitation and LC-MS/MSanalysis.The Ingenuity Pathway Analysis(IPA)softwarewas employed for bioinformatics analysis on the differentially-expressed proteins.RESULTS:A total of20 differentially-expressed tyrosine-phosphorylated proteins were identified by MS，including 8 markedly up-regulated and 10 evidently down-regulated proteins.IPA software suggested that these proteinsweremainly associated with the disease of cancer，tissue development and function，and cell death and survival.CONCLUSION:We successfully identified PTPLAD1-regulated differentially-expressed tyrosinephosphorylated proteins in colon cancer cell line HCT-116.Our analysis suggests that PTPLAD1-regulated proteins in colon cancer are closely correlated with colon cancer.

［KEY WORDS］Protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1;HCT-116 cells;Small interfering RNA;Stable isotope labeling with amino acid;Phosphoproteomics

腸癌在全球發(fā)病率高居第三，在消化道類腫瘤中的發(fā)病率僅次于胃癌。到目前為止，已知的致癌基因中有3/4是酪氨酸激酶介導(dǎo)的，因而更多的關(guān)注投向了對(duì)酪氨酸激酶的研究［1］。人類中已經(jīng)研究較為清楚的編碼蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)家族的基因有107個(gè)，它們?cè)谡{(diào)控細(xì)胞生理和病理進(jìn)程的許多方面發(fā)揮重要作用，而且具有一些重要的結(jié)構(gòu)特征，如特征序列(H/V)C (X)5R(S/T)組成的活性部位和外部常見環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是它們發(fā)揮催化作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［2］。

含蛋白酪氨酸磷酸酶樣A結(jié)構(gòu)域蛋白1(protein tyrosine phosphatase-like A domain containing protein 1，PTPLAD1)是屬HACD極長(zhǎng)鏈脂肪酸脫水蛋白家族成員，在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)3-羥酰輔酶A氧化還原酶有4種同工酶，PTPLAD1(HACD3)分子即為其中的1種［3］。由于PTPLAD1含有與PTPs標(biāo)志性催化活性位點(diǎn)非常類似的氨基酸序列(H/V)C(X)5R(S/ T)，它可能與PTPs具有相似的信號(hào)調(diào)節(jié)功能。目前關(guān)于PTPLAD1在機(jī)體中的作用報(bào)道較少，主要集中在紅細(xì)胞分化及丙型肝炎病毒復(fù)制方面［4-5］，我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTPLAD1在結(jié)腸癌中是低表達(dá)的。為了進(jìn)一步研究其分子機(jī)理，我們用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾，可以從整體上觀察細(xì)胞或組織中磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化，即所謂磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)［6-7］。本研究通過siRNA技術(shù)沉默PTPLAD1的表達(dá)，利用細(xì)胞培養(yǎng)條件下的氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stable isotope labelingwith amino acid in cell culture，SILAC)定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合免疫共沉淀富集技術(shù)，鑒定了PTPLAD1差異調(diào)控的酪氨酸磷酸化蛋白及這些蛋白磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步對(duì)這些差異酪氨酸磷酸化蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從而揭示PTPLAD1在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中調(diào)控酪氨酸磷酸化蛋白變化的情況，并分析其參與的信號(hào)通路。

材料和方法

1主要試劑

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HCT-116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫;siRNA干擾片段合成購(gòu)自GenePharma;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine iMAX購(gòu)自Invitrogen;胎牛血清和基本細(xì)胞液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco; TRIzol?Reagent購(gòu)自Life Technologies;逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自TaKaRa;BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SILAC試劑盒為Pierce產(chǎn)品;IP裂解液和RIPA裂解液(強(qiáng))購(gòu)自碧云天公司;磷酸酶和蛋白酶抑制劑(Cocktail)購(gòu)自Roche;PTPLAD1鼠單抗購(gòu)自Abcam;Phospho-Tyrosine鼠單抗購(gòu)自Cell Signaling;Protein A/G PLUS-Agarose購(gòu)自Santa Cruz;actin抗體和胰蛋白酶為Promega產(chǎn)品;引物由Invitrogen設(shè)計(jì)合成，見表1。

表1　Real-time PCR引物序列Table 1 Sequences of real-time PCR primers

2主要儀器

倒置顯微鏡(Nikon);蛋白電轉(zhuǎn)儀和real-time PCR儀為Bio-Rad產(chǎn)品;酶標(biāo)儀(BioTek);流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson);LTQ Orbitrap XL組合式質(zhì)譜(Thermo);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force);超凈工作臺(tái)為江蘇蘇凈安泰公司產(chǎn)品;小型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf);純水系統(tǒng)(Millipore)。

3主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)、PTPLAD1序列同源性比對(duì)及其干擾片段設(shè)計(jì)將結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞接種于6孔板中，用含有10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃、100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將PTPLAD1蛋白進(jìn)行NCBIBLAST在線同源序列比對(duì)分析，PTPLAD1 siRNA序列根據(jù)GenScript公司網(wǎng)上設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)，由蘇州吉瑪生物公司合成了3對(duì)PTPLAD1基因的干擾片段，見表2。

表2　si-PTPLAD1干擾片段序列Table 2.Sequences of si-PTPLAD1

3.2RNAi沉默PTPLAD1基因表達(dá)

3.2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾效率待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用Lipofectamine iMAX脂質(zhì)體，分別轉(zhuǎn)染si-PTPLAD1(3對(duì))、熒光標(biāo)記si-FAM和陰性對(duì)照(negative control，NC)siRNA(si-NC)，轉(zhuǎn)染24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察si-FAM轉(zhuǎn)染情況，并分別收集熒光標(biāo)記的si-FAM和si-NC組細(xì)胞，通過C6 Flow Cytometer System檢測(cè)siRNA的轉(zhuǎn)染效率。

3.2.2Real-time PCR篩選PTPLAD1有效干擾片段將這3種干擾片段轉(zhuǎn)染到HCT-116細(xì)胞，24～48 h后提取細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，real-time PCR檢測(cè)3種干擾片段的干擾效果。

3.2.3Western blot確定有效干擾時(shí)間在HCT-116中轉(zhuǎn)染有效的si-PTPLAD1片段，0 h、24 h、48 h和72 h后，收取不同時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法測(cè)蛋白濃度定量后，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮5 min，進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，將膜與Ⅰ抗(鼠抗人PTPLAD1抗體1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，PBST洗膜，再與兔抗鼠HRPⅡ抗在室溫下孵育1 h，PBST洗膜，將膜與ECL發(fā)光底物結(jié)合，曝光，顯影。

3.3酪氨酸磷酸化蛋白的富集及其定量蛋白組學(xué)

3.3.1SILAC標(biāo)記HCT-116細(xì)胞將50 mg［13C6］L-lysine-2HCl(重)和50 mg L-arginine-HCl(輕)徹底溶解于1 mL培養(yǎng)基。將溶解的氨基酸加入到含10%胎牛血清的500 mL培養(yǎng)基，加入青霉素和鏈霉素至終濃度100 mg/L，徹底混合均勻，用0.22μm的濾膜過濾除菌，在瓶上標(biāo)記“重”。重復(fù)上述步驟再配制輕鏈標(biāo)記的培養(yǎng)基。配制好的SILAC培養(yǎng)基4℃避光保存，并于6個(gè)月內(nèi)使用。用SILAC培養(yǎng)基對(duì)HCT-116進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記HCT-116(heavy)和HCT-116(light)，標(biāo)記完全后(7代)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.3.2免疫共沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白及定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)組si-PTPLAD1干擾重鏈標(biāo)記的HCT-116(heavy)，對(duì)照組si-NC干擾輕鏈標(biāo)記的HCT-116(light)，24 h后用胰酶消化收集細(xì)胞，用IP裂解液分別裂解實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，BCA法測(cè)蛋白濃度，輕重鏈蛋白進(jìn)行等量混合后，用鼠IgG及瓊脂糖珠子洗蛋白裂解液去除非特異結(jié)合蛋白，加入抗酪氨酸磷酸化抗體4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，再加入瓊脂糖珠子4℃孵育4 h，洗珠子去除非特異性結(jié)合蛋白，行SDS-PAGE，銀染，將銀染條帶進(jìn)行切割分成40等份，脫色，蛋白質(zhì)還原烷基化，胰蛋白酶膠內(nèi)酶解，肽段萃取、凍干，然后多肽通過液相色譜偶聯(lián)LTQ-Orbitrap XL分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Max Quant軟件處理得到差異蛋白，Ingenity Pathway Analysis(IPA)軟件對(duì)差異蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1PTPLAD1蛋白結(jié)構(gòu)及功能分析

在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTPLAD1在結(jié)腸癌中是低表達(dá)的，為了進(jìn)一步揭示該蛋白的功能，我們首先通過NCBIBLAST對(duì)PTPLAD1蛋白362個(gè)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)PTPLAD1主要含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，如圖1所示，前1～125個(gè)氨基酸具有與p23相似的結(jié)構(gòu)域，而p23是作為HSP90的輔助分子伴侶發(fā)揮功能的，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子和信號(hào)蛋白具有調(diào)控作用。后196～362結(jié)構(gòu)域?qū)儆赑TPLA超家族，而PTPLA蛋白家族含有典型的PTPs標(biāo)志性催化活性位點(diǎn)(H/V)C(X)5R(S/T)。PTPLA主要參與發(fā)育、分化及維持組織分化類型，于是我們推測(cè)PTPLAD1具有PTPs的功能，并且可能在腫瘤發(fā)生中扮演著重要的角色。

Figure 1.Structure and functional domains of PTPLAD1.The former region of PTPLAD1 is homologouswith p23，and its latter region belongs to PTPLA superfamily.圖1　PTPLAD1蛋白結(jié)構(gòu)及功能分析

2RNAi沉默PTPLAD1基因表達(dá)

為進(jìn)一步研究PTPLAD1在腫瘤中的抑制作用，我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中敲低PTPLAD1來探索細(xì)胞的磷酸化蛋白變化情況。首先我們用倒置熒光顯微鏡觀察到si-FAM成功轉(zhuǎn)染到HCT-116細(xì)胞中，細(xì)胞發(fā)綠色熒光，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA(si-FAM)的效率達(dá)90%以上。Real-time PCR篩選有效的si-PTPLAD1，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為418和1045這2種干擾片段效果較好，Western blot實(shí)驗(yàn)表明成功干擾PTPLAD1基因的表達(dá)及在24 h干擾效果較好，見圖2。

Figure 2.PTPLAD1 knockdown by siRNA in HCT-116 cell line.A:carboxyfluorescein-labelled siRNA(si-FAM)in the transfected cancer cells were observed under inverted fluorescent contrast-phasemicroscope(×200);B:the efficiency of RNA interference in colon cancer cellswas detected by flow cytometry;C:the effectiveness of the interference fragments of PTPLAD1 (si-418，si-710 and si-1045)was evaluated;D:Western blot analysis of PTPLDA1 in HCT-116 cells after knockdown of PTPLAD1 by siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.圖2　結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中siRNA高效沉默PTPLAD1基因表達(dá)

3免疫共沉淀富集酪氨酸磷酸化蛋白及定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究PTPLAD1調(diào)控的磷酸化組學(xué)變化

PTPLAD1具有典型的PTPs結(jié)構(gòu)域，其變化必然引起細(xì)胞內(nèi)部磷酸化蛋白的變化，為研究該蛋白所調(diào)控的磷酸化蛋白的變化情況，我們?cè)谟肧ILAC標(biāo)記的結(jié)腸癌細(xì)胞中敲低PTPLAD1，并運(yùn)用免疫共沉淀的方法富集酪氨酸磷酸化蛋白，通過質(zhì)譜共鑒定出有定量信息的蛋白質(zhì)20個(gè)，表達(dá)差異倍數(shù)(heavy/ light)大于2或小于0.5的蛋白質(zhì)共18個(gè)，其中在HCT-116細(xì)胞中上調(diào)8個(gè)，下調(diào)10個(gè)(圖3)，相應(yīng)這些差異蛋白鑒定到的差異磷酸化位點(diǎn)見表3。利用IPA軟件對(duì)這些差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，得出2條分值較高的相關(guān)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)通路，主要與器官發(fā)育分化、維持組織分化類型及與細(xì)胞凋亡增殖相關(guān)(圖4)。進(jìn)一步對(duì)這些蛋白質(zhì)作功能聚類分析，與腫瘤疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)18個(gè)，與細(xì)胞生存及死亡相關(guān)的蛋白質(zhì)8個(gè)，與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞組裝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)各6個(gè)，與胚胎發(fā)育及組織分化相關(guān)蛋白各5個(gè)。從對(duì)差異蛋白質(zhì)的功能分類結(jié)果表明，PTPLAD1在結(jié)腸癌細(xì)胞調(diào)控的磷酸化蛋白主要影響細(xì)胞形態(tài)、組裝及組織分化與發(fā)育等方面。其中鑒定到許多轉(zhuǎn)錄因子及腫瘤標(biāo)志物相關(guān)蛋白，如E2F8和CA125，分別在HCT-116細(xì)胞中上調(diào)0.2倍和17.7倍，見表4。

Figure 3.SILAC-IP quantitative proteomics to identify PTPLAD1-regulated phosphorylated proteins in colon cancer cell line HCT-116.A:theworkflow of the SILAC-based quantitative proteomics coupled with immunoprecipitation;B:differential ratio of the phosphorylated proteins regulated by PTPLAD1.圖3　SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合酪氨酸免疫共沉淀技術(shù)鑒定PTPLAD1在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116中所調(diào)控的磷酸化蛋白

討論

有研究證實(shí)，結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)多原因參與、多階段發(fā)展、多步驟積累、多基因改變的疾病，涉及到多種癌基因的擴(kuò)增和高表達(dá)，以及抑癌基因的失活等［1］。我們對(duì)PTPLAD1的蛋白序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PTPLAD1含有與酪氨酸磷酸酶PTP標(biāo)志性催化活性位點(diǎn)非常類似的氨基酸序列(H/V) C(X)5R(S/T)。多項(xiàng)研究表明PTPs在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用，一些人類疾病如某些癌癥、糖尿病、白血病、免疫缺陷病、諾南氏綜合癥等正是由PTPs的基因突變或異常表達(dá)造成的［8］。盡管PTPLAD1蛋白含有類似PTPs，對(duì)于它是否在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮功能未見報(bào)道。

PTPLAD1(HACD3)是用丁酸鈉處理成纖維細(xì)胞時(shí)被鑒定到的，丁酸鈉通常被用來抑制細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其分化。研究人員稱PTPLAD1與激活的Rac1形成復(fù)合物，可能參與組成Rac1信號(hào)通路并對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用［5］。有研究報(bào)道，該家族另一蛋白成員PTPLAD2在人食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)低于其在正常食管鱗狀上皮中的表達(dá)。PTPLAD2在癌組織浸潤(rùn)廣泛、腫瘤細(xì)胞分化較低及伴有淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移的病例中表達(dá)較低，PTPLAD2可能是食管癌發(fā)生及進(jìn)展中的抑癌基因［9-10］。PTPLAD1與PTPLAD2同屬于HACD家族成員，具有重要的序列相似性，這提示PTPLAD1可能與腫瘤的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

本研究通過免疫共沉淀結(jié)合SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了PTPLAD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116蛋白磷酸化水平的影響。在敲低PTPLAD1的情況下，用抗酪氨酸磷酸化的抗體成功富集了酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)并結(jié)合LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜鑒定了PTPLAD1差異表達(dá)所調(diào)控的酪氨酸磷酸化蛋白及這些蛋白磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步利用IPA軟件對(duì)這些差異酪氨酸磷酸化蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析［11］。

表3　PTPLAD1所調(diào)控蛋白的磷酸化位點(diǎn)Table 3.The phosphorylation sites of PTPLAD1-regulated proteins

Figure 4.The functional signaling networks associated with PTPLAD1 by IPA analysis.A:PTPLAD1-related functional signaling network 1 mainly involved in organmorphology，skeletal and muscular system development and function，and cellular compromise;B:network 2 mainly involved in cell death and survival，gene expression，and cellular growth and proliferation.圖4　IPA軟件分析PTPLAD1及其調(diào)控的磷酸化相關(guān)蛋白

從分析結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)與腫瘤疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)18個(gè)，與細(xì)胞生存及死亡相關(guān)的蛋白質(zhì)8個(gè)，與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞組裝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)各6個(gè)。從對(duì)差異蛋白質(zhì)的功能分類結(jié)果表明，PTPLAD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞磷酸化的調(diào)控，主要體現(xiàn)在影響細(xì)胞形態(tài)、組裝及組織分化與發(fā)育等方面。其中有許多轉(zhuǎn)錄因子及腫瘤標(biāo)志物相關(guān)蛋白，如E2F8和CA125，也受到了PTPLAD1差異表達(dá)的影響。

本研究運(yùn)用RNAi技術(shù)結(jié)合高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)PTPLAD1調(diào)控的差異酪氨酸磷酸化蛋白做出了初步探索。在對(duì)PTPLAD1所調(diào)控的差異酪氨酸磷酸化蛋白進(jìn)行的功能蛋白組學(xué)分析中，我們鑒定出了多個(gè)在結(jié)腸癌細(xì)胞中酪氨酸磷酸化異常增高和降低的蛋白。生物信息學(xué)分析表明PTPLAD1調(diào)控的差異酪氨酸磷酸化蛋白主要是與癌癥、血液系統(tǒng)疾病及免疫性疾病相關(guān)，并參與器官發(fā)育分化、維持組織分化類型及細(xì)胞凋亡增殖相關(guān)通路。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究PTPLAD1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)理提供了線索。

表4　PTPLAD1涉及到的主要疾病及生物學(xué)功能Table 4.Diseases and biofunctions involved by PTPLAD1

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Phosphoproteom ics to analyze PTPLAD1-regulated tyrosine-phosphorylated proteins in colon cancer cells

HU Yang，YANG Jie，YU Ru-yuan，WANG Yang
(Key Laboratory of Functional Protein Research ofGuangdong Higher Education Institutes，Collegeof Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:wangyang8857@gmail.com)

R329.2+1;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.014

1000-4718(2015)05-0845-07

2014-12-31［修回日期］2015-03-02

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(No.2011CB910700)

Tel:020-85227039;E-mail:wangyang8857@gmail.com