梁孟亞，唐志賢，陳光獻，榮健，戴剛，吳鐘凱(中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州510080)

深低溫停循環(huán)下幼豬腦皮質HIF-1與NGB的表達及作用*

梁孟亞，唐志賢，陳光獻，榮健，戴剛，吳鐘凱△
(中山大學附屬第一醫(yī)院心臟外科，廣東廣州510080)

目的:觀察深低溫停循環(huán)(DHCA)下幼豬腦皮質缺氧誘導因子1(HIF-1)與神經珠蛋白(NGB)的表達變化。方法:五指山豬共15頭隨機分成體外循環(huán)組(CPB組)、深低溫停循環(huán)組(DHCA組)與深低溫停循環(huán)選擇性順行腦灌注組(SACP組)。建立體外循環(huán)后，DHCA組降溫至18℃后停循環(huán)40 min，SACP組停循環(huán)后經無名動脈順行腦灌注40 min。復灌180 min后取腦皮質組織行HE染色鏡檢，Western blot及real-time PCR檢測HIF-1α、NGB蛋白表達及mRNA水平。結果:HE染色顯示與DHCA組相比SACP組腦組織損傷顯著減輕。復灌180 min后DHCA組及SACP組腦皮質中HIF-1α的蛋白及mRNA水平均顯著高于CPB組(P＜0.05)，同時SACP組動物腦組織HIF-1α的蛋白及mRNA水平顯著高于DHCA組(P＜0.05)。復灌180min后DHCA組及SACP組腦皮質中NGB的蛋白及mRNA水平均顯著高于CPB組(P＜0.05)，同時SACP組動物腦組織NGB的蛋白及mRNA水平顯著高于DHCA組(P＜0.05)。結論:HIF-1與NGB的表達上調參與了腦組織對DHCA腦損傷的反應機制，并可能是SACP腦保護作用的機制之一。

深低溫停循環(huán);選擇性順行腦灌注;缺氧誘導因子1;神經珠蛋白

［ABSTRACT］AIM:To observe the expression of hypoxia-inducible factor1(HIF-1)and neuroglobin(NGB)in piglet cortex during deep hypothermic circulatory arrest.METHODS:Wuzhishan piglets were random ly assigned to cardiopulmonary bypass group(CPB group)，40 min of circulatory arrest(CA)at18℃without cerebral perfusion(DHCA group)or with selective antegrade cerebral perfusion(SACP group).After180min of reperfusion，cortical tissuewas harvested for determining HIF-1αand NGB expression by HE staining，Western blotand real-time PCR.RESULTS:Severer cerebral injury was observed in DHCA group than that in SACP group.After 180 min of reperfusion，HIF-1αprotein and mRNA levelswere significantly higher in DHCA group than those in CPB group(P＜0.05).Accordingly，SACP animal had higher levels of HIF-1αprotein andmRNA than those in DHCA group(P＜0.05).Simultaneously，higher NGB protein and mRNA levels were found in DHCA group than those in CPB group after 180 min of reperfusion(P＜0.05).The SACP animal had higher levels of NGB protein and mRNA than those in DHCA group(P＜0.05).CONCLUSION:Upregulation of HIF-1 and NGB are involved in themechanism against cerebral injury resulting from DHCA in the cortex and possibly a part of cerebral protective effect of SACP.

［KEY WORDS］Deep hypothermic circulatory arrest;Selective antegrade cerebral perfusion;Hypoxia-inducible factor 1;Neuroglobin

深低溫停循環(huán)(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)目前廣泛用于主動脈弓手術及復雜先天性心臟病矯治手術，但術后出現(xiàn)的神經系統(tǒng)損害是主要并發(fā)癥。DHCA導致的腦損傷目前機制尚未十分明確［1］。近年的研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)通路在腦缺血損傷中扮演重要角色［2］，然而DHCA過程中HIF-1的表達情況尚未有文獻報道。神經珠蛋白(neuroglobin，NGB)是新近發(fā)現(xiàn)的一類主要存在于神經系統(tǒng)的高氧親和力珠蛋白，其在腦卒中的角色越來越受到重視，有研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下HIF-1可調控NGB的表達，提示兩者間存在功能聯(lián)系，目前HIF-1及NGB是否參與腦組織對DHCA腦損傷的反應機制未有研究涉及。近年來應用選擇性順行腦灌注(selective antegrade cerebral perfusion，SACP)在減輕DHCA導致的術后腦損傷方面取得較好的療效，其腦保護機制部分可能與提高腦組織對缺氧應激的應答能力相關［3］。HIF-1及NGB是腦組織應對缺氧損傷的重要應答因子，而目前尚未有研究分析兩者在SACP中的表達改變。本研究旨在通過建立幼豬DHCA模型觀察HIF-1及NGB在DHCA動物腦皮質的中的表達變化，并探討其在SACP腦保護機制中的作用。

材料和方法

1動物、藥品、試劑和儀器

健康雄性2～4月齡五指山小型香豬15頭，體重(11.27±2.70)kg，由廣州白云實驗動物研究所提供。

HIF-1和NGB抗體購自Abcam;Trizol購自Invitrogen;HRP標記Ⅱ抗(HRP2025)購自Forevergen; ReverTra Ace qPCR試劑盒購自Toyobo Biochemicals;SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒購自Bio-Rad。

體外循環(huán)管道及膜肺(Medtronic);人工心肺機(Stoker);變溫水箱(Sarns);多導生理記錄儀(BIOPAC);動物麻醉呼吸機(Bird Vela);自動取樣槍(Bard MAGNUM);紫外凝膠分析系統(tǒng)(Bio-Rad); TC-200型PCR儀(MJReseareh)。

2方法

2.1實驗動物分組五指山小型香豬共15頭按照隨機原則分為3組，每組5只:(1)體外循環(huán)組(CPB組):動物經歷40 min并行體外循環(huán)作為對照組;(2)深低溫停循環(huán)無腦灌注組(DHCA組):動物接受18℃單純深低溫停循環(huán)40 min;(3)深低溫停循環(huán)選擇性順行腦灌注組(SACP組):動物接受18℃深低溫停循環(huán)40 min，同時經無名動脈行順行腦灌注。

2.2深低溫停循環(huán)與逆行腦灌注操作實驗動物由靜脈注射芬太尼2μg/kg，維庫溴銨0.1 mg/kg誘導后行氣管插管。以七氟醚吸入，芬太尼及維庫溴銨靜脈注射維持麻醉。股動、靜脈分別置管并連接多導生理記錄儀監(jiān)測平均動脈壓及中心靜脈壓。手術操作與體外循環(huán)流程均模擬臨床心臟手術過程。胸骨正中切口，右心房內注射肝素3 mg/kg肝素化后，主動脈和上、下腔靜脈分別插入10F主動脈插管和2條12F靜脈插管，并連接人工心肺機。體外循環(huán)管道及膜肺使用乳酸林格液預充。灌流流量維持于75～80 mL·kg－1·min－1，平均動脈壓維持于50～80 mmHg之間。體外循環(huán)開始后，逐漸降溫直至鼻咽溫18℃。CPB組不進行降溫，阻斷主動脈后順行灌注心肌停跳液致心臟停跳，體外循環(huán)轉流40 min后開放主動脈。DHCA組動物鼻咽溫降至目標溫度后開始停循環(huán)40 min。SACP組于停循環(huán)開始后經右無名動脈按20 mL·kg－1·min－1流量順行灌注，其余主動脈弓血管以套索收緊阻斷，灌注壓力維持于45～50 mmHg。停循環(huán)40 min后，開放主動脈恢復流量復溫直至鼻咽溫達到36℃。復灌180 min后處死實驗動物，開顱后留取腦皮質組織，置于2.5%戊二醛及0.1 mmol/L甲次砷酸鹽混合溶液中固定并于4℃冷凍保存，或于－70℃低溫冰箱保存?zhèn)湎乱徊綑z測。

2.3腦皮質組織HE染色腦皮質組織以10%甲醛固定24 h后經梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片后經蘇木素伊紅染色，置于光學顯微鏡下觀察。

2.4Western blot測定腦皮質HIF-1α和NGB蛋白表達取100 mg腦皮質組織，剪碎后加入300μL RIPA裂解液進行勻漿，4℃、16 000×g離心30 min，收集中層蛋白液體。采用Bradford進行蛋白定量。所使用SDS凝膠濃度為12%。電泳前，100℃沸煮蛋白樣本5 min，使蛋白變性。電泳條件為恒壓200 V 45 min。轉膜條件為恒壓200 V 60 min。封閉液(5%脫脂奶粉溶于TBST)封閉1 h。4℃搖晃孵育HIF-1Ⅰ抗(1∶1 000)和NGBⅠ抗(1∶1 000)過夜。采用HRP標記Ⅱ抗(1∶3 000)常溫孵育1 min。TBST緩沖液室溫下?lián)u床搖動洗膜3次。ECL發(fā)光液化學發(fā)光法顯色。結果圖片使用Image J軟件測定灰度值。以GAPDH(1∶5 000)作為內參照，比較不同處理后上述蛋白表達的差異。

2.5腦皮質HIF-1α和NGBmRNA的real-time PCR檢測取腦皮質組織加入Trizol液中根據(jù)操作規(guī)程進行總RNA提取，然后應用ReverTra Ace qPCR試劑盒進行反轉錄，引物如下:HIF-1的上游引物為5’-GCTACAACATCACCATACAG-3’，下游引物為5’-GCGACAGATAACACATTAGG-3’;NGB的上游引物為5’-CCCTCTTCCAGTACAACT-3’，下游引物為5’-CAATCACAAGCATCACCTT-3’;β-actin的上游引物為5’-TGTTGACAATGGATCCGGTA-3’，下游引物為5’-CTGCTGGAAGGTGGAGAGAG-3’。應用SsoFast EvaGreen Supermix試劑盒進行cDNA擴增，實驗體系如下:SsoFast EvaGreen Supermix 10μL;模板DNA 2μL;引物0.4μmol/L。擴增參數(shù)為98℃2 min; 98℃5 s，57℃30 s，共40個循環(huán)。產物凝膠電泳后用圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

3統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。連續(xù)指標數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析檢驗組間均數(shù)差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1腦皮質HE染色

動物腦皮質HE染色結果顯示，CPB組動物腦皮質毛細血管擴張充血明顯，組織結構基本正常。DHCA組皮質神經元排列紊亂，細胞皺縮，染色質結緊及胞漿濃縮明顯，細胞周圍有空泡形成，局部液化性壞死。多數(shù)小血管明顯充血，周圍淋巴細胞圍繞呈“袖套”樣。SACP組腦皮質結構基本正常，組織輕度水腫，部分血管擴張充血，炎癥細胞浸潤不明顯，其組織結構損傷程度較DHCA組顯著減輕，見圖1。

Figure 1.The histopathological changes of the frontal cortex(HE staining，×400).圖1　腦皮質HE染色結果

2腦皮質HIF-1α及NGB蛋白表達結果

復灌180 min后DHCA組及SACP組HIF-1α的表達均顯著高于CPB組(P＜0.01)，另外SACP組動物腦組織HIF-1α的表達顯著高于DHCA組(P＜ 0.01)，見圖2。復灌3 h后DHCA組及SACP組NGB的表達均顯著高于CPB組(P＜0.01)，此外SACP組動物腦組織NGB的表達顯著高于DHCA組(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.HIF-1αlevels in the frontal cortex at180min of reperfusion determined byWestern blotanalysis.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs DHCA group.圖2　W estern blot檢測腦皮質HIF-1α蛋白的水平

Figure 3.The neuroglobin(NGB)levels in the frontal cortex at180 min of reperfusion determined byWestern blot.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs DHCA group.圖3　W estern blot檢測腦皮質神經珠蛋白的水平

3腦皮質HIF-1α及NGBm RNA的表達結果

在再灌注3 h后應用real-time PCR方法檢測3組動物皮質HIF-1α及NGB的mRNA表達。復灌3 h后DHCA組及SACP組HIF-1α的mRNA水平均明顯高于CPB組(P＜0.01);有腦灌注的SACP動物腦組織HIF-1α的mRNA水平顯著高于DHCA組(P＜0.05)。另外再灌注3 h后DHCA組及SACP組NGB的mRNA水平均明顯高于CPB組(P＜0.01);有腦灌注的SACP動物腦皮質組織中NGB的mRNA水平顯著高于DHCA組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.ThemRNA expression of HIF-1αand neuroglobin(NGB)in the frontal cortex at180 min of reperfusion determined by realtime PCR.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs DHCA group.圖4　Real-time PCR檢測腦皮質HIF-1α及NGB的m RNA表達水平

討論

目前對DHCA腦損傷的機制研究認為，腦組織在停循環(huán)期間及再灌注后經歷一系列復雜的代謝環(huán)境變化過程，代謝環(huán)境的急劇變化及缺血缺氧刺激誘導腦神經細胞及膠質細胞產生應答機制，啟動一系列相關蛋白因子的表達，這一過程被認為是腦組織應對DHCA腦損傷的修復機制的一部分。HIF-1是細胞在缺氧條件下產生的核蛋白，是由α亞基和β亞基組成的具有轉錄活性的異源二聚體，HIF-1α是其中的主要活性亞基，組織缺氧過程中與靶基因增強子或啟動子上的缺氧反應元件(hypoxia response element，HRE)結合，啟動目的基因的轉錄，發(fā)揮其對組織缺血缺氧的反應機制［4］。目前發(fā)現(xiàn)的HIF-1的靶基因包括促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)基因、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因及葡萄糖載體蛋白1的編碼基因等，這些基因編碼的蛋白因子對缺血缺氧后組織修復具有重要作用［5］。HIF-1是組織應對缺氧缺血的重要應答因子與啟動環(huán)節(jié)，有研究顯示慢性缺氧動物腦組織中檢測到HIF-1蛋白表達的上調，亦有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1高表達基因型大鼠腦組織對缺氧刺激的耐受能力顯著高于野生型［2］，提示HIF-1表達上調對熱缺血損傷腦組織具有保護作用。目前對于DHCA腦損傷過程中HIF-1的表達變化及其是否參與腦組織應對DHCA腦損傷的相關機制尚未有文獻報道。

NGB是近年發(fā)現(xiàn)的存在于脊椎動物中樞神經系統(tǒng)的對氧有高親和力的珠蛋白，在成年大鼠腦皮層、海馬回、丘腦、下丘腦、嗅球和小腦等部位均檢測到NGB的廣泛表達，已被證實與腦局灶性缺氧缺血相關［6］。有研究證實NGB過表達基因型鼠較野生型對缺血缺氧有較強的抵御能力［7］。NGB對腦組織缺血缺氧損傷的保護作用可能與維持線粒體功能及清除氧自由基有關，NGB與氧分子有高親和性，可以協(xié)助氧氣通過血腦屏障，并且在神經組織代謝過程中增加氧的運輸、儲存和供應。另有研究發(fā)現(xiàn)NGB在大腦不同區(qū)域的表達與該區(qū)域對局部缺血的敏感性成反比，海馬回等部位對缺血的高敏感性和易損性與此類區(qū)域的NGB表達偏低相關［8］。目前針對腦卒中過程中NGB所起作用已有諸多研究涉及，但對DHCA腦損傷過程中NGB蛋白的表達變化尚未得到充分研究。

本研究首次通過幼豬模型研究了DHCA過程中HIF-1與NGB的表達變化及其相互關系，證實DHCA可導致HIF-1與NGBmRNA與蛋白表達的上調，其變化可持續(xù)到再灌注后3 h。同時我們也觀察到了存在腦灌注(SACP)條件下HIF-1與NGB mRNA與蛋白表達亦出現(xiàn)上調，且兩者的表達水平顯著高于無腦灌組。本研究結果證實了HIF-1參與了針對DHCA腦損傷的反應機制，鑒于先前研究已經證實HIF-1對熱缺血損傷腦組織具有保護作用，我們推斷HIF-1表達升高是腦組織應對DHCA腦損傷啟動的自我保護機制，而且SACP組動物腦組織HIF-1表達的大幅提高提示其與SACP的腦保護作用有一定關聯(lián)。另一方面，本研究在動物實驗中證實NGB參與了腦組織對DHCA腦損傷的反應機制，目前對于低氧誘導NGB表達的具體機制尚不清楚，但本研究觀察到NGB的表達在SACP組腦組織中要顯著高于無腦灌組，提示NGB表達上調可能參與了SACP的腦保護機制。既往有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α特異性siRNA可以在小鼠體內抑制增強子誘導的NGB表達［9］。另外有文獻報道HIF-1的誘導因子，如鈷和去鐵敏等，均能增強NGB的表達，提示在低氧條件下HIF-1可介導NGB的表達［10］。HIF-1作用靶基因的共同特點是在啟動子或增強子中含有HIF-1結合位點缺氧反應原件，而在NGB基因5’端非編碼區(qū)也發(fā)現(xiàn)了多條HIF-1結合位點相同序列，提示NGB可能為HIF-1的靶基因之一，在機體對腦缺血的應答過程中兩者之間可能存在一定功能聯(lián)系［11］。本研究結果證實在深低溫停循環(huán)期間HIF-1與NGB存在共同的表達上調趨勢，提示兩者間可能存在功能聯(lián)系，但HIF-1是通過何種途徑介導NGB的表達上調尚需要進一步研究。

綜上所述，本研究利用幼豬DHCA模型證實了HIF-1與NGB的表達上調參與了腦組織對DHCA腦損傷的反應機制，同時亦證實了兩者的表達上調可能與SACP的腦保護機制相關。

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Expression of hypoxia-inducible factor 1 and neuroglobin in piglet cortex during deep hypotherm ic circulatory arrest

LIANG Meng-ya，TANG Zhi-xian，CHEN Guang-xian，RONG Jian，DAI Gang，WU Zhong-kai
(The Second Department of Cardiac Surgery，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:wuzkdr@126.com)

R654.1;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.010

1000-4718(2015)05-0823-05

2014-12-08［修回日期］2015-03-12

國家自然科學基金資助項目(No.81400307)

Tel:020-87332200;E-mail:wuzkdr@126.com