梁偉杰，陳景福，張穩(wěn)柱，莫利求，鄭東誕，宋明才，潘玩瑩，馮鑒強，廖新學(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東廣州00;中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，麻醉科，廣東廣州0700;中山大學附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科，廣東廣州0080)

ATP敏感性鉀通道在硫化氫抑制高糖引起的心肌細胞損傷中的作用*

梁偉杰1，2，陳景福3，張穩(wěn)柱1，2，莫利求4，鄭東誕3，宋明才1，2，潘玩瑩4，馮鑒強4，廖新學5△
(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東廣州511400;中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)3心血管內(nèi)科CCU，4麻醉科，廣東廣州510700;5中山大學附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科，廣東廣州510080)

目的:研究ATP敏感性鉀通道(KATP通道)在硫化氫(H2S)抑制高糖引起心肌損傷中的作用。方法:應用Western blot法檢測心肌細胞KATP通道蛋白的表達水平;CCK-8試劑盒測定心肌細胞存活率;Hoechst 33258染色測定凋亡細胞數(shù)量的變化;JC-1染色法測定線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果:應用高糖(35 mmol/L葡萄糖)處理H9c2細胞1～24 h，其中6 h、9 h、12 h和24 h均能明顯下調(diào)KATP通道蛋白的水平，12 h和24 h KATP水平降至最低。在HG處理心肌細胞12 h前，應用400μmol/L硫氫化鈉(NaHS，為H2S的供體)預處理30 min明顯抑制高糖對KATP通道蛋白表達的下調(diào)作用。100μmol/L線粒體KATP通道開放劑二氮嗪和50μmol/L非選擇性KATP通道開放劑吡拉地爾(Pin)及NaHS預處理均顯著抑制高糖引起的心肌細胞損傷，使細胞存活率升高，凋亡細胞數(shù)量及MMP丟失減少。相反，100μmol/L線粒體KATP通道阻斷劑5-羥基癸酸和1 mmol/L非選擇性KATP通道阻斷劑格列本脲均能明顯阻斷上述NaHS的心肌細胞保護作用。結(jié)論:KATP通道介導了H2S對高糖引起的心肌細胞損傷的抑制作用。

ATP敏感性鉀通道;硫化氫;心肌細胞

［ABSTRACT］AIM:To investigate the roles of ATP-sensitive potassium(KATP)channels in high glucose-induced cardiac injury and the inhibitory effect of hydrogen sulfide(H2S)on the cardiomyocyte injury.METHODS:The expression level of KATPchannel protein was tested byWestern blot.The cell viability wasmeasured by CCK-8 assay.The number of apoptotic cells was observed by Hoechst 33258 nuclear staining.Mitochondrialmembrane potential(MMP)was examined by JC-1 staining.RESULTS:After the H9c2 cellswere treated with 35mmol/L glucose(high glucose，HG)for1～24 h，the protein level of KATPchannelwas significantly reduced at6 h，9 h，12 h and 24 h，reaching theminimum level at12 h and 24 h.Pretreatmentof the cellswith 400μmol/LNaHS(a donor of H2S)prior to exposure to HG for12 h considerably blocked the down-regulation of KATPchannels induced by HG.Pretreatment of the cells with 100μmol/L mitochondrial KATPchannel opener diazoxide，50μmol/L non-selective KATPchannel opener pinacidil or NaHSobviously inhibited HG-induced injuries，leading to an increase in the cell viability，and decreases in the number of apoptotic cells and the MMP loss.Pretreatmentwith 100μmol/Lmitochondrial KATPchannel antagonist5-hydroxydecanoic acid or 1mmol/L nonselective KATPchannel antagonist glibenclamide attenuated the above cardioprotective effects of NaHS.CONCLUSION: KATPchannelsmediate the inhibitory effect of H2S on HG-induced cardiac injury.

［KEY WORDS］ATP-sensitive potassium channels;Hydrogen sulfide;Cardiomyocytes

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)長期以來被認為是一種有毒的氣體。但是，體內(nèi)的組織、器官，如腦、心血管等均能產(chǎn)生內(nèi)源性的H2S［1-2］，是繼NO和CO之后第3種內(nèi)源性氣體信號分子。近年來，越來越多的研究證實，H2S具有多種生理與病理生理功能。在心血管系統(tǒng)，H2S能舒張血管平滑肌［3］;能減輕心肌梗塞引起心室功能障礙和心衰發(fā)展［4］及保護H9c2心肌細胞對抗缺氧引起的損傷［5］。ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channels，KATPchannels)被第一個認為是H2S的靶分子。根據(jù)存在的部位，KATP通道主要分為細胞膜KATP通道和線粒體KATP通道。Bian等［6］報道，KATP通道介導外源性H2S預處理對缺血引起心肌損傷的抑制作用。

最近，H2S在糖尿病心血管并發(fā)癥中的作用受到關(guān)注。有報道指出，2型糖尿病患者及鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠，其血漿H2S水平明顯降低［7］。近年，我們證實外源性H2S能通過調(diào)控p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)及瘦素(leptin)通路，保護H9c2心肌細胞對抗高糖引起的損傷［8-9］。但是，KATP通道在H2S對抗高糖引起的心肌損傷中的作用及其機制尚不明確。

為此，本研究建立高糖損傷H9c2心肌細胞模型［8］，旨在探討:(1)高糖對心肌細胞KATP通道蛋白表達水平的影響;(2)NaHS(為H2S的供體)預處理能否抑制高糖對KATP通道蛋白表達的抑制作用;(3) KATP通道開放劑能否抑制高糖引起的心肌細胞損傷; (4)KATP通道阻斷劑能否減弱外源性H2S的心肌細胞保護作用。

材料和方法

1材料

NaHS、Hoechst 33258和JC-1(Sigma);二氮嗪(diazoxide，DZ)、吡拉地爾(pinacidil，Pin)、5-羥基癸酸(5-hydroxydecanoic acid，5-HD)和格列本脲(glibenclamide，Gli)購自Cayman;細胞計數(shù)試劑盒8 (Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自Dojindo;DMEM培養(yǎng)基(HyClone);特級胎牛血清(Gibco);抗KATP抗體(Santa Cruz)。H9c2心肌細胞由中山大學實驗動物中心提供。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)H9c2心肌細胞來源于大鼠胚胎期的心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2實驗分組實驗分為12組:⑴正常對照組(control):DMEM培養(yǎng)基處理心肌細胞24 h;⑵高糖(high glucose，HG)組:35 mmol/L葡萄糖處理24 h;⑶NaHS+HG組:400μmol/L NaHS作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖處理24 h;⑷5-HD+NaHS+HG組:100μmol/L 5-HD作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，后續(xù)實驗步驟與第⑶實驗組相同;⑸Gli+NaHS+HG組:1 mmol/LGli作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，后續(xù)實驗步驟與第⑶實驗組相同;⑹DZ+HG組: 100μmol/L DZ作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著35 mmol/L葡萄糖處理24 h;⑺Pin+HG組:50μmol/L Pin作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著35 mmol/L葡萄糖處理24 h;⑻NaHS組:400μmol/L NaHS作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h;⑼5-HD組:100μmol/L 5-HD作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h;⑽Gli組: 1 000μmol/LGli作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h;⑾DZ組:100 μmol/L DZ作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h;⑿Pin組:50μmol/L Pin作用心肌細胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h。

2.3Western blot法檢測KATP通道蛋白將H9c2心肌細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至細胞融合至80%時，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷的PBS洗3次，加入裂解液，4℃靜置30 min，12 000 r/ min離心10 min，取上清，然后采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗KATP(1∶1 000)抗體，4℃過夜，然后用TBST洗3次，每次5 min，與相應的II抗(1∶3 000)室溫孵育1.5 h，用TBST洗3次，每次5 min。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。重復5次。

2.4CCK-8測定細胞存活率將H9c2心肌細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當心肌細胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，按各分組處理后，于每孔中加入10 μL CCK-8試劑和90μL DMEM，輕搖，37℃孵育2.5 h，用酶標儀記錄各孔450 nm處吸光度值(A)。取5孔A值的平均數(shù)，按下列公式計算細胞存活率:細胞存活率(%)=處理組A/對照組A×100%，重復5次。

2.5Hoechst33258核染色檢測細胞凋亡將H9c2心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在細胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時，按各分組處理后，用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛于4℃環(huán)境中固定10min，加入含5 mg/L Hoechst 33258試劑，于37℃溫箱孵育30 min，在熒光顯微鏡下(Nikon)攝片，鑒別正常的心肌細胞和凋亡的心肌細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片，重復5次。

2.6JC-1染色測定線粒體膜電位(mitochondrial menbrane potential，MMP)將H9c2心肌細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當細胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時，上述各實驗組經(jīng)不同的處理因素作用后，用PBS沖洗3次，用10μg/L JC-1的無血清培養(yǎng)基于37℃溫箱中孵育45 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區(qū)攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了JC-1的線粒體。用ImageJ 1.47i軟件分析5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統(tǒng)計分析。重復5次。

3統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q進行均數(shù)之間的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1高糖抑制心肌細胞KATP通道蛋白的表達

應用高糖(35mmol/L葡萄糖)處理H9c2心肌細胞1～24 h，6 h時開始，KATP通道蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01)，9 h時進一步降低(P＜0.01)，12 h和24 h時降至最低水平(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.High glucose inhibited the expression of KATPchannels in H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs0 h group.圖1　高糖抑制心肌細胞KATP通道蛋白的表達

2H2S減弱高糖對心肌細胞KATP通道蛋白表達的抑制

應用高糖處理心肌細胞12 h使KATP通道蛋白表達明顯減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但是，在高糖處理心肌細胞前，應用400 μmol/L NaHS預處理30 min使高糖對KATP通道蛋白表達的抑制作用顯著減弱，與高糖組比較，差異顯著(P＜0.01)。400μmol/L NaHS本身對心肌細胞KATP通道蛋白的基礎(chǔ)表達水平無明顯的影響，見圖2。

Figure 2.H2S ameliorated the inhibitory effect of HG on KATPchannel protein expression.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖2　H2S減弱高糖對心肌細胞KATP通道蛋白表達的抑制作用

3KATP通道介導H2S抑制高糖引起的心肌細胞毒性

應用0.06、0.08、0.10、0.12、0.14和0.16 mmol/L線粒體KATP通道開放劑DZ預處理H9c2心肌細胞30 min也明顯地抑制HG引起的心肌細胞毒性，升高細胞存活率(P＜0.01)。0.06～0.16 mmol/ L DZ本身對心肌細胞存活率無顯著影響。另一方面，應用0.03、0.04、0.05、0.06、0.07和0.08 mmol/ L非選擇性KATP通道開放劑Pin預處理H9c2心肌細胞30 min均能明顯抑制高糖引起的心肌細胞毒性，使細胞存活率升高，與HG組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但0.03～0.08 mmol/L Pin本身對心肌細胞的存活率無明顯的影響。值得注意的是，線粒體KATP通道開放劑對抗高糖細胞毒性的作用與非選擇性KATP通道開放劑比較，兩者無明顯差異(P＞0.05)。與KATP通道開放劑的作用相似，400 μmol/L NaHS預處理心肌細胞30 min能明顯地抑制高糖引起的心肌毒性，使細胞存活率升高，與HG組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但是，應用100 μmol/L線粒體KATP通道阻斷劑5-HD或1 mmol/L非選擇性KATP通道阻斷劑Gil預處理30 min均明顯地減弱H2S的抗高糖心肌毒性作用，使心肌細胞存活率降低，與NaHS預處理組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。5-HD或Gli本身對細胞存活率無明顯的影響，見圖3。

Figure 3.KATPchannelsmediated the inhibitory effect of H2Son HG-induced cytotoxicity in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=6.＊＊P＜0.01 v s control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group;△△P＜0.01 vs NaHS+HG group.圖3　KATP通道介導H2S對高糖引起的心肌細胞毒性的抑制作用

4KATP通道介導H2S對高糖致心肌細胞凋亡的抑制作用

Hoechst核染色的檢測結(jié)果顯示，正常的H9c2心肌細胞的染色質(zhì)分布均勻，呈現(xiàn)出彌散均勻的低密度熒光。應用35 mmol/L葡萄糖處理心肌細胞24 h后，呈現(xiàn)典型的凋亡特征(即細胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光)的細胞數(shù)量增多，與正常對照組比較差異顯著(P＜0.01)。然而，100μmol/L DZ和50μmol/L Pin預處理H9c2心肌細胞30 min均能顯著地減少凋亡細胞的數(shù)量，與HG組比較，差異顯著(P＜0.01)。但是，線粒體KATP通道開放劑對HG致心肌細胞凋亡的抑制作用與非選擇性KATP通道開放劑比較無明顯差異(P＞0.05)。與KATP通道開放劑的作用相似，400μmol/L NaHS預處理心肌細胞30 min能明顯抑制高糖致心肌細胞凋亡的作用，使凋亡細胞數(shù)量明顯減少，與HG組比較，差異顯著(P＜0.01)。但是，應用100μmol/L線粒體KATP通道阻斷劑5-HD或非選擇性KATP通道阻斷劑Gli預處理30min均明顯減弱H2S的抗高糖致心肌細胞凋亡作用，使心肌細胞凋亡數(shù)量增加，與NaHS預處理組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。5-HD或Gli本身對細胞凋亡數(shù)量無明顯的影響(P＞0.05)，見圖4。

5KATP通道介導H2S對高糖致心肌細胞線粒體膜電位丟失的抑制作用

HG作用于H9c2心肌細胞24 h可使胞內(nèi)JC-1的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI;反映MMP大小的指標)從(78.60±0.62)%降低至(51.10±0.07)%，差異顯著(P＜0.01)。然而，100 μmol/L DZ和50μmol/L Pin預處理H9c2心肌細胞30 min均能顯著減少MMP的丟失，使MFI分別升高至(67.10±0.15)%和(67.20±0.25)%，與HG組比較差異顯著(P＜0.01)。但是，線粒體KATP通道開放劑對HG致心肌細胞MMP丟失作用與非選擇性KATP通道開放劑比較無明顯差異(P＞0.05)。

與KATP通道開放劑的作用相似，400μmol/L NaHS預處理心肌細胞30 min能明顯地抑制高糖的致心肌細胞MMP丟失，使MFI升高至(64.10± 0.17)%，與HG組比較差異顯著(P＜0.01)。但是，應用100μmol/L線粒體KATP通道阻斷劑5-HD或非選擇性KATP通道阻斷劑Gli預處理30 min均明顯減弱H2S對高糖致心肌細胞MMP丟失的抑制作用，使心肌細胞MFI分別降低至(50.70±0.67)%和(50.60±0.32)%，與NaHS預處理組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。5-HD或Gli本身對心肌細胞MMP無明顯的影響(P＞0.05)，見圖5。

Figure 4.KATPchannelsmediated the inhibitory effect of H2S on HG-induced apoptosis of H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group;△△P＜0.01 vs NaHS+HG group.圖4　KATP通道介導H2S對高糖致心肌細胞凋亡的抑制作用

Figure 5.KATPchannelsmediated the inhibitory effect of H2S on HG-induced loss ofmitochondrialmember potential(MMP)in the H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group;△△P＜0.01 vs NaHS+ HG group.圖5　KATP通道介導H2S對高糖致心肌細胞線粒體膜電位丟失的抑制作用

討論

KATP通道是一種受細胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控的內(nèi)向整流鉀通道，它于1983年被Noma等［10］首先在心肌細胞發(fā)現(xiàn)。隨后的研究證實，該通道還廣泛存在于胰腺、平滑肌等可興奮組織，發(fā)揮重要的生理和病理生理作用。有研究表明，高血糖可通過損傷人血管內(nèi)皮細胞的KATP通道而損傷血管，但是KATP通道在高血糖損傷心肌細胞中的作用及其機制尚未完全清楚。為了探討此重要的學術(shù)問題，本研究首先觀察高糖對H9c2心肌細胞KATP通道蛋白表達的影響。研究結(jié)果表明，高糖明顯地抑制H9c2心肌細胞KATP通道蛋白的表達，提示高糖可通過抑制KATP通道繼而損傷心肌細胞。為了驗證這個推斷，本研究進一步探討了線粒體KATP通道開放劑二氮嗪和非選擇性KATP通道開放劑吡拉地爾對高糖誘導的心肌細胞毒性、細胞凋亡及線粒體損傷(MMP丟失)的作用。結(jié)果表明，二氮嗪和吡拉地爾均能明顯地抑制高糖引起的心肌細胞毒性、致凋亡作用及線粒體損傷作用;而且這2種KATP通道開放劑的心肌細胞保護作用沒有明顯差異，提示:(1)抑制KATP通道活動可能是高糖引起心肌細胞毒性、致凋亡作用及線粒體損傷的機制之一;(2)線粒體KATP通道的開放可能在抑制高糖引起的心肌細胞損傷中起著更重要的作用，但是，要證實這一點，需要進一步觀察膜KATP通道開放劑的作用，并與線粒體KATP通道開放劑的作用比較。最近，Bian等［6］報道，線粒體KATP通道和膜KATP通道介導缺血預處理引起的心肌保護作用，本文的研究結(jié)果與他們的相類似，提示KATP通道能保護心肌細胞對抗高糖引起的上述多種損傷。值得注意的是，應用于2型糖尿病治療的磺脲類(sulfonylureas，SUs)藥物，其藥理作用主要是通過關(guān)閉KATP通道，促進胰島素的分泌，從而發(fā)揮降糖作用。SUs藥物自20世紀50年代起一直使用至今，目前仍為主要的口服降糖藥物之一，具有方便、價廉的特點。但基于某些SUs藥物能同時阻斷心肌細胞KATP通道的緣故，長期應用有增加心臟病死亡率的風險。因此，對于不同的SUs藥物應用于臨床之前，需先對其可能的心臟損害作用作充分的評估。

最近，我們證實外源性H2S能保護H9c2心肌細胞對抗高糖引起的心肌細胞毒性、致凋亡作用和MMP丟失［8-9］。由于H2S是KATP通道的開放劑［3］，KATP通道介導H2S對缺血引起心肌損傷的抑制作用［6］，因此，本研究進一步探討KATP通道在H2S保護心肌細胞對抗高糖損傷中的作用。研究結(jié)果表明，NaHS預處理能明顯地減弱高糖對心肌細胞KATP通道蛋白表達的抑制作用;另一方面，線粒體KATP通道阻斷劑5-羥基癸酸和非選擇性KATP通道阻斷劑格列本脲能顯著地減弱NaHS對高糖引起的心肌細胞毒性、致凋亡作用和MMP丟失的抑制作用，提示促進KATP通道蛋白的表達及激活KATP通道可能是外源性H2S保護心肌細胞對抗高糖損傷的重要機制之一。與本研究的結(jié)果相似，Hu等［11］觀察到，線粒體KATP通道在H2S抑制魚藤酮(rotenone，為一種殺蟲藥)引起的神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的凋亡中起著重要的作用。

綜上所述，本研究證實，高糖可通過抑制KATP通道損傷心肌細胞;外源性H2S可通過調(diào)控KATP通道對抗高糖引起的心肌損傷。本文為防治糖尿病心肌損傷提供了新思路。

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Role of ATP-sensitive potassium channels in inhibitory effect of hydrogen sulfide on high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells

LIANG Wei-jie1，2，CHEN Jing-fu3，ZHANG Wen-zhu1，2，MO Li-qiu4，ZHENG Dongdan3，SONG Ming-cai1，2，PANWan-ying4，F(xiàn)ENG Jian-qiang4，LIAO Xin-xue5
(1Department of Cardiology，Central Hospital of Panyu District，2Cardiovascular Institute of Panyu District，Guangzhou 511400，China;3Cardiac Care Unit of Department of Cardiology，4Department of Anesthesiology，Huangpu Division of The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510700，China;5Departmentof Hypertension and Vascular Diseases，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.003

1000-4718(2015)05-0785-06

2015-02-11［修回日期］2015-04-17

國家自然科學基金資助項目(No.81270296);廣東省財政科技項目(No.2014SC107)

Tel:020-87332628;E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn