蔣刈　籍靈超　李北成　戴樸　韓東一*解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京00480）2福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學系、福建省立醫(yī)院耳鼻咽喉科（福州35000）

·綜述·

基因治療技術的發(fā)展在耳聾功能及治療研究方面的應用

蔣刈1、2籍靈超1李北成1戴樸1韓東一1*
1解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100480）
2福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學系、福建省立醫(yī)院耳鼻咽喉科（福州350001）

基因治療是指將外界正?；蛑委熁?，通過載體轉移到人體的靶細胞，進行基因修飾和表達，從而改善疾病的一種治療手段?；蛑委煹母拍钭钤缡窃?972年由Friedmann和Roblin提出［1］。既往以同源重組（Homologous Recombination，HR）修復機制為基礎的基因打靶（gene targeting）技術在研究基因功能方面發(fā)揮重要作用并用于基因治療的探索。近幾年基于同源重組修復機制和不依賴于同源重組的非同源末端連接（Non Homologous End Joining，NHEJ）機制的基因組編輯（genome editing）技術開創(chuàng)了基因研究及治療的新天地。

1　基因打靶技術的發(fā)展

基因打靶是應用同源重組的原理，在胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）技術基礎上發(fā)展起來的，將外源性DNA定點修飾改造染色體目的基因的方法，包括基因敲除（knock out）和基因敲入（knock in）技術?；虼虬泻蠖ㄏ蚋淖兗毎蛘呱飩€體遺傳信息并使修飾后的遺傳信息通過生殖系遺傳，表達突變的性狀，已成為一種較理想的改造生物遺傳物質的實驗方法。

20世紀70年代在釀酒酵母中得以應用的基因敲除技術［2］和20世紀80年代早期建立的胚胎干細胞技術［3］為基因打靶提供了基礎。1985年，Smithies等［4］首次在哺乳動物細胞中進行的基因打靶，將一段外源質粒利用同源重組技術插入到人染色體的β-球蛋白位點基因間。1987年，Smithies［5］和Capecchi MR［6］兩個研究小組同時報道在小鼠ES細胞中進行基因敲除。此后，基因敲除的小鼠ES細胞研究蓬勃發(fā)展，現(xiàn)已成為研究基因結構功能和建立人遺傳性疾病模型的一種常規(guī)實驗方法。1981年Sternberg從Pl噬菌體中發(fā)現(xiàn)Cre-LoxP系統(tǒng)，1994年，Zimmer等［7］首次應用Cre-LoxP系統(tǒng)研制的組織特異性基因敲除小鼠問世以后，條件基因敲除技術迅速取代了傳統(tǒng)的完全基因敲除而成為主流［8］。條件基因敲除技術利用Cre-LoxP系統(tǒng)和FLP-FRT系統(tǒng)，用在特定階段特定組織或細胞中表達Cre或FLP重組酶的轉基因小鼠與在基因組中引入LoxP或FRT序列的小鼠交配，可導致子代鼠中特定組織或細胞中的靶基因刪除。基因打靶多用于小鼠ES細胞研究，所建立的小鼠模型包括癌基因和腫瘤抑制基因、免疫相關基因、生長因子與受體基因等［9-13］，多與人類遺傳性疾病有關。

體細胞克隆技術的發(fā)展使得利用克隆技術生產(chǎn)轉基因動物成為科學家們研究的熱點。1997年，Schnieke等［14］首次將凝血因子Ⅸ基因用脂質體包埋法轉染胚胎成纖維細胞，篩選的陽性細胞進行核移植，獲得轉基因克隆羊“Polly”，是這項技術的標志。之后通過核移植生產(chǎn)的體細胞基因打靶綿羊［15］、敲除α-1，3-半乳糖苷酶基因的克隆豬［16］都獲得了成功。2007年10月8日，美國科學家Mano R.Capecchi，Oliver Smithies和英國科學家Martin J.Evans因為在“基因打靶技術”方面的奠基性貢獻分享了該年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。2007年，日本科學家利用臉部細胞［17］和美國科學家利用新生兒包皮細胞［18］均成功制成了誘導多能干細胞（iPS），被《自然》和《科學》分別評為2007年第一和第二大科學進步。

隨著基因敲除技術的發(fā)展，早期技術中的許多不足和缺陷多已經(jīng)解決，但始終存在著難以克服的缺點：即基因功能與表型分離和基因敲除致死性，導致無法對這些相應的基因進行研究［19］。

2　基因打靶技術在遺傳性耳聾基因功能研究及治療方面運用

基于同源重組技術和胚胎干細胞技術基礎上發(fā)展起來的基因打靶、條件基因敲除和體細胞克隆技術，已廣泛運用于內耳發(fā)育及內耳基因功能研究中，這些基因主要是通過編碼轉錄因子、生長因子、離子轉運通道或神經(jīng)遞質受體蛋白等重要的生物分子調控內耳發(fā)育［20-36］。（見表2、表3）

表2　基因打靶與部分內耳相關基因功能研究

在耳聾基因治療領域，1996年，Lalwani等［37］將遺傳物質直接導入外周聽系，開啟了對感音神經(jīng)性耳聾基因治療的探索。2005年，Sage等［38］通過在RB1基因條件敲除小鼠內耳重新恢復RB1基因功能獲得功能性毛細胞的再生。同年，Izumikawa等［39］利用腺病毒載體將Atoh1基因導入藥物性致聾豚鼠內耳，觀察其聽力得到改善，受損的部分毛細胞得到恢復甚或產(chǎn)生新的毛細胞。2012年，Lustic等［40］通過腺病毒載體介導基因轉染技術使Vglut3基因敲除小鼠恢復聽力。2013年，Lentz等［41］利用糾正前體mRNA剪接缺陷的反義寡核苷酸（ASO）對新出生的Usher綜合征小鼠模型進行經(jīng)腹腔注射，使小鼠低頻聽力提高、前庭功能改善。但ASO治療策略只在發(fā)育早期階段（P5-P10）有效，并且效果短暫，限制了它在人類的應用。2014年，Yu等［42］通過直接注射方式，將外源性Gjb2基因導入Gjb2基因敲除的小鼠模型后發(fā)現(xiàn)該基因編碼的Cx26表達于內耳支持細胞系統(tǒng)，縫隙連接通道形成，但模型小鼠的聽力沒有改善。2015年，Charles Askew等［43］運用腺相關病毒載體對Tmc1基因缺失小鼠進行治療，在隱性遺傳耳聾小鼠模型中檢測到聲音刺激下毛細胞電流感知，在顯性遺傳小鼠模型中部分恢復小鼠功能并持續(xù)2個月。這是基因治療遺傳性耳聾方面的重大突破，然而研究手段制備動物模型周期長、效率低、有不同程度細胞致死性以及不可預知的脫靶情況，仍然限制了科學家們在探索基因型和表型關系的科研道路上前進的步伐［44］。安全和有效的基因治療手段來實現(xiàn)基因缺陷性小鼠模型的聽功能修復是研究者探尋的目標。

3　基因技術新進展--基因組編輯技術

近年來興起了新一代基因組編輯技術，包括：鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和成簇可調控間隔短回文重復RNA引導核酸酶（clustered regulatory interspaced shortpalindromicrepeatsCRISPR/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases，CRISPR/Cas）。從分子生物學角度上說此三項技術均屬于基因定點修飾技術，本質上均利用依賴于同源重組（HR）的修復機制和不依賴于同源重組的非同源末端連接（NHEJ）機制，聯(lián)合特異DNA靶向識別及核酸內切酶完成DNA序列改變。新一代基因組編輯技術可實現(xiàn)基因組任意位置的基因敲除（knock out）、刪除（deletion）或外源基因敲入（knock in）、基因融合（gene integration），進行生物基因組改造、基因功能分析、動植物育種抗病研究。此類技術以高效率、高精確度對基因組進行人工修飾，對目的基因組操作的效率較同源重組技術有明顯的提高，敲除效果更加徹底，并且降低了脫靶情況［45，46］。

ZFNs技術和TALENs技術均是通過與Fok I非特異性核酸內切酶結構域形成異源二聚體完成特定位點剪切。因不需要通過ES細胞打靶環(huán)節(jié)，可以直接通過原核注射的方式實現(xiàn)目的基因的編輯，極大的縮短了建立基因敲除動物模型的時間，拓寬了基因修飾的物種范圍。主要不同是構建靶點識別模塊方式：ZFNs技術由特異性識別序列的鋅指DNA結合域和Fok I切割結構域兩部分組成的蛋白核酸酶實現(xiàn)內源基因的定點修飾。鋅指DNA結合域部分一般包含3個重復的獨立鋅指結構，每個鋅指能夠識別3個堿基因，一個鋅指DNA結合域可以識別9bp長度的特異性序列，而ZFN二聚體包含6個鋅指，可以識別18bp長度特異序列。因ZFN技術實現(xiàn)了人類培養(yǎng)細胞系中ZFN介導的基因敲除［47］和基因定點敲入［48］。被《科學》雜志評為2009年生命科學領域十大創(chuàng)新技術之一。TALENs技術是根據(jù)目標DNA序列構建一對TAL靶點識別模塊與N端的核定位序列、C端的Fok I酶連接，得到完整的TALEN元件。天然的TALEN元件識別的特異性DNA序列長度一般為17-18bp，而人工TALEN元件識別的特異性DNA序列長度一般為14-20bp。TALEN最少可識別1個堿基數(shù)量。TALEN技術自從2009年Moscou等［49］破解了Tale蛋白能夠特異性識別和結合宿主DNA的作用機制及2011年Cermak［50］進行人工Tale蛋白的改造后，已經(jīng)逐漸成為基因組定點靶向修飾的主要技術，開啟人類多功能干細胞進行定向的基因操作探索，《科學》雜志在2012年度評論中將TALEN技術比作基因組的“巡航導彈”。

表3　基因打靶與部分綜合征性耳聾基因功能研究

CRISPR/Cas系統(tǒng)［51］由Cas蛋白基因、前導序列和主體CRISPR基因座共同構成。根據(jù)作用機制中Cas蛋白基因的差異性將CRISPR系統(tǒng)分為3種類型，在II型CRISPR系統(tǒng)中，主要利用Cas9：sgRNA復合體作為基因組編輯工具。其中Cas9蛋白具有核酸內切酶功能，sgRNA（Single guide RNA）嵌合體由三部分組成：一段回文序列形成的發(fā)卡結構為Cas9蛋白的結合位點，由crRNA-tracRNA改造而成，一段長度約為12-20bp與目標DNA互補的RNA單鏈序列（basepairing region）以及一段終止序列（terminator）。crRNA（CRISPR RNA）通過堿基對連接反式編碼小RNA（trans-encoded small RNA，tracrRNA）形成的二元RNA結構能指導Cas9蛋白對幾乎所有DNA序列進行剪切。與ZFN和TALENs相比，CRISPR-Cas9在操作的簡便性、實驗周期、效率等方面更有優(yōu)勢，具體表現(xiàn)在①無物種限制，靶向精確性更高，可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除；②使用方便，費用低廉；③CRISPR/Cas系統(tǒng)只需改變很短的RNA序列（不超過100bp）就可實現(xiàn)不同位點的特異性識別，可避免超長、高度重復的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥［52］。2013年多篇關于利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在多種動植物內［53-56］進行多重基因組重組編輯的報道，開啟了第三代人工核酸酶成為研究熱點的新篇章，而《Nature》將通過CRISPR/Cas9技術獲得世界首例基因敲除食蟹猴的成果，稱為人類疾病模型發(fā)展的里程碑［57］。

4　基因組編輯技術在遺傳性耳聾基因功能研究及治療方面運用

目前基因組編輯技術在內耳基因功能研究方面開展剛剛起步，2014年，Nagel-Wolfrum等［58］在研究Usher綜合征的p.R31X基因突變中，運用ZFN技術將病變處雙鏈斷裂，重組正常的基因片段修復病變。2015年，F(xiàn)rancis等［59］運用CRISPR/Cas9技術改變了Xin-actin binding repeat containing（XIRP2）表達，導致小鼠高頻聽力下降，并發(fā)現(xiàn)XIRP2在靜纖毛長期功能保持中發(fā)揮作用。由于基因組編輯技術可用于生殖細胞、內耳毛細胞和支持細胞的研究，2015年，Zuris等［60］在Atoh1-GFP轉基因小鼠耳蝸調控Atoh1功能使外毛細胞高表達GFP，利用陽離子脂質轉運系統(tǒng)RNAiMAX/Lipofectamine將具有靶向基因修飾作用Cas9：sRNA直接注入小鼠耳蝸后，在原表達GFP的外毛細胞出現(xiàn)明顯的GFP缺失。這是首次運用CRISPR/cas9技術把蛋白質-RNA復合體直接成功地傳遞到哺乳動物組織體內并實現(xiàn)的基因組編輯的重大事件，證實這項技術可用于遺傳性聽力損失小鼠模型聽力恢復，是從基因水平糾正耳蝸局部致病突變的首次成功探索。

CRISPR/Cas技術在遺傳性耳聾治療方面應用潛力巨大。同時，在眾多基因組編輯技術中，該技術優(yōu)勢明顯，是遺傳學研究領域的未來發(fā)展趨勢。將CRISPR/Cas這一前沿技術應用于內耳研究，實現(xiàn)對遺傳性耳聾基因的靶向編輯、糾正突變，將為耳聾治療帶來新的希望。

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R764.43

A

1672-2922（2015）04-750-5

2015-11-3審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.045

國家自然基金重點項目（81230020）；國家自然基金面上項目（81371096）

蔣刈，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：耳科學及耳聾基因

韓東一，Email：hdy301@263.net