李曉澤　馬衛(wèi)平　胡志鵬　藥澤蓉　魏魏山西省長(zhǎng)治市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳室（長(zhǎng)治046011）

·臨床研究·

長(zhǎng)治地區(qū)19113例新生兒耳聾基因檢測(cè)

李曉澤馬衛(wèi)平胡志鵬藥澤蓉魏魏
山西省長(zhǎng)治市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳室（長(zhǎng)治046011）

目的用耳聾基因芯片方法檢測(cè)19113名新生兒是否存在中國(guó)人常見(jiàn)耳聾基因的異常。方法采集2013年6月-12月長(zhǎng)治市轄區(qū)內(nèi)出生的19113名新生兒足跟血并提取DNA，應(yīng)用耳聾基因芯片檢測(cè)4個(gè)常見(jiàn)耳聾基因的9個(gè)突變位點(diǎn)，包括GJB2（35 del G，176_191del 16，235 del C，299_300 del AT）、GJB3 （538 C＞T）、SLC26A4（IVS 7-2 A＞G，2168 A＞G）和線(xiàn)粒體DNA 12S rRNA（1555 A＞G，1494 C＞T）。同時(shí)對(duì)19113名新生兒的基本信息進(jìn)行了調(diào)查，包括聽(tīng)力學(xué)檢查。結(jié)果 19113名新生兒中，共檢測(cè)出耳聾基因異常者984例（5.15%），其中GJB2基因雜合突變437例（2.29%），235de1C純合突變2例（0.01%），線(xiàn)粒體DNA 12S rRNA突變66例（0.35%），SLC26A4基因雜合突變型395例（2.07%），GJB3基因雜合突變62例（0.32%），雙雜合突變型22例（0.12%）。結(jié)論長(zhǎng)治地區(qū)新生兒常見(jiàn)耳聾基因突變以GJB2基因突變、SLC26A4基因突變?yōu)橹??；蛲蛔兟室猿菂^(qū)、長(zhǎng)治縣和襄垣縣居多，新生兒耳聾基因篩查可以對(duì)藥物性耳聾、PDS綜合征等聽(tīng)力篩查無(wú)法檢測(cè)的遲發(fā)性耳聾進(jìn)行檢測(cè)。

新生兒；耳聾基因；突變；基因芯片

耳聾是常見(jiàn)的殘疾之一?？茖W(xué)家研究顯示，超過(guò)60%的耳聾是由遺傳因素造成的［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每1000個(gè)新生兒中就有1～3例聾兒。2013年召開(kāi)的世界衛(wèi)生組織全球防聾合作中心會(huì)議暨中國(guó)聽(tīng)力論壇上報(bào)告顯示，我國(guó)現(xiàn)有聽(tīng)力殘疾者2780萬(wàn)人，其中，0～6歲聽(tīng)障兒童約13.7萬(wàn)，且每年以2.3萬(wàn)的數(shù)量遞增［1-2］，而其中至少一半的聾兒是由于遺傳缺陷引起的，可見(jiàn)遺傳因素在致聾中所起的重要作用［3］。因此，正確作出病因分析，提出早期干預(yù)措施，是降低耳聾發(fā)生的有效途徑。本研究應(yīng)用耳聾基因芯片技術(shù)對(duì)19113例新生兒進(jìn)行常見(jiàn)遺傳性耳聾基因的診斷，結(jié)合傳統(tǒng)的新生兒聽(tīng)力篩查，更加全面的對(duì)新生兒進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)的篩查，避免耳聾發(fā)生。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

2013年6月-12月長(zhǎng)治市轄區(qū)內(nèi)出生的19113名新生兒，收集研究對(duì)象基本信息患者的聽(tīng)力學(xué)檢查。采集19113名新生兒足跟血2滴并密封保存，提取DNA，進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)。

1.2儀器德國(guó)chemagen全自動(dòng)DNA提取儀晶芯?SlideWasher8芯片洗干儀、長(zhǎng)風(fēng)XMTD6000水浴箱、晶芯?LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀-523nm、BIOER Life Express PCR儀、微量核酸濃度測(cè)定儀。

1.3試劑

對(duì)984例耳聾基因突變者按地區(qū)進(jìn)行分析，可見(jiàn)城區(qū)、長(zhǎng)治縣和襄垣縣突變率居各縣市區(qū)首位，分別為8.26%、5.51%和4.99%。見(jiàn)表3。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1血片DNA的提取

用德國(guó)PE公司的CMG-777全自動(dòng)DNA提取儀提取干血片DNA 50μl。

1.5質(zhì)量控制

1.4.2PCR擴(kuò)增

術(shù)后隨訪6個(gè)月～4年，其中1例雙側(cè)聲帶乳頭狀瘤患者分別于術(shù)后3個(gè)月、10個(gè)月復(fù)發(fā)，再次給于CO2切除，其中一例未復(fù)發(fā)，1例復(fù)發(fā)并癌變，行額側(cè)喉部分切除。其余17例治愈。其中2例發(fā)生聲帶前部粘連。所有患者術(shù)后均未出現(xiàn)呼吸困難、出血等并發(fā)癥發(fā)生。

1.4.2.1PCR反應(yīng)體系：

25μl的PCR反應(yīng)體系包括：PCR擴(kuò)增試劑引物混合物A 20 μl，模板DNA5.0 μl；PCR擴(kuò)增試劑引物混合物B 20 μl，模板DNA 5.0 μl。

1.4.2.2PCR擴(kuò)增程序

（以0.5℃/s的速度從94℃降溫至55℃；以0. 2℃/s的速度從55℃升溫至70℃）擴(kuò)增程序見(jiàn)表1。

影響蜂蜜黏度的關(guān)鍵因素是溫度和蜂蜜的含水量，在5 ℃～25 ℃范圍內(nèi)，蜂蜜的黏度隨溫度升高而降低，隨含水量升高而降低且含水量越低的蜂蜜黏度對(duì)溫度的變化越敏感。

1.4.3芯片雜交

按每份樣品4 μ1磁珠和20 μ1結(jié)合液進(jìn)行配制，混勻后分裝到8聯(lián)排管中。將擴(kuò)增好的產(chǎn)物A、B分別取10 μ1加入到配制好的磁珠中，混勻后靜置10min，磁力板吸附棄廢液，每份樣品中加入0.1mol/L NaOH 60μ1，混勻，靜置10min，磁力板吸附棄廢液，再加入提前50℃預(yù)熱的雜交緩沖液40μ1，磁力板吸附棄廢液，加入20μ1雜交緩沖液。將雜交反應(yīng)混合物經(jīng)蓋片上的加樣孔垂直加入14 μ1雜交混合物，迅速蓋上雜交盒蓋并密封。將密封好的雜交盒水平放入50℃預(yù)熱的水浴箱中雜交60 min。

1.4.4芯片洗滌

雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交盒水平取出拆開(kāi)，將芯片取出，放入芯片洗滌機(jī)中按程序進(jìn)行洗滌，洗滌完成后放入芯片甩干機(jī)中離心3-5min。

1.4.5芯片掃描

DNA提取、PCR擴(kuò)增、雜交過(guò)程的所有試劑及器皿均進(jìn)行嚴(yán)格的消毒。對(duì)無(wú)法判斷結(jié)果的樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并隨機(jī)抽取5%樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。樣品DNA濃度純度測(cè)定按照5%進(jìn)行抽檢，濃度純度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.4.6結(jié)果判讀

QC：表面化學(xué)質(zhì)控探針　PC：雜交陽(yáng)性對(duì)照探針I(yè)C：基因擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照探針　BC：空白對(duì)照探針NC：陰性對(duì)照探針　MC：磁珠質(zhì)控探針

若在同個(gè)位點(diǎn)中W行檢測(cè)數(shù)據(jù)為陽(yáng)性，同時(shí)M行為陰性，判讀結(jié)果為該位點(diǎn)野生型；若在同個(gè)位點(diǎn)中W行檢測(cè)數(shù)據(jù)為陽(yáng)性，同時(shí)M行為陽(yáng)性，判讀結(jié)果為該位點(diǎn)突變雜合型；若在同個(gè)位點(diǎn)中W行檢測(cè)數(shù)據(jù)為陰性，同時(shí)M行為陽(yáng)性，判讀結(jié)果為該位點(diǎn)突變純合型。

根據(jù)全省閃電監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析顯示,7月27日19:00—20:00,在事發(fā)地5 km范圍內(nèi),共監(jiān)測(cè)到4次負(fù)地閃,強(qiáng)度分別為25.7～43.6 kA,地閃位置距離事發(fā)地分別為0.97～3.46 km。廊橋附近的監(jiān)控視頻顯示,27日19:35事發(fā)前后,廊橋所在地出現(xiàn)大風(fēng)、雷電、降雨等天氣。

為了進(jìn)一步刻畫(huà)研究區(qū)縣域經(jīng)濟(jì)的時(shí)間演變特征，采用ArcGIS的自然間斷點(diǎn)分級(jí)法，將綜合經(jīng)濟(jì)得分排名變化劃分為三類(lèi)，分別表示綜合實(shí)力穩(wěn)定區(qū)、綜合實(shí)力上升區(qū)和綜合實(shí)力下降區(qū)三種類(lèi)型，繪制了2000—2015年成都平原城市群縣域經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平變化圖(見(jiàn)圖1).

使用晶芯?LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀進(jìn)行芯片掃描，使用晶芯?遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)的讀取及判斷。

表1　PCR擴(kuò)增程序

表2　19113例耳聾患者耳聾基因檢測(cè)結(jié)果

2　結(jié)果

2.119113例新生兒耳聾基因檢測(cè)結(jié)果

440C高碳高鉻馬氏體不銹鋼鍛件是公司承接的某公司用軸承應(yīng)力環(huán)鍛件。兩批次鍛件的理化試樣在長(zhǎng)時(shí)間退火后進(jìn)行淬火，在淬火冷卻過(guò)程中和冷處理過(guò)程中均出現(xiàn)了開(kāi)裂現(xiàn)象。為找出斷裂失效原因，對(duì)淬裂樣件進(jìn)行了分析檢測(cè)。

19113名新生兒中，共檢測(cè)出耳聾基因異常者984例（5.15%），其中GJB2基因雜合突變437例（2.30%），235de1C純合突變2例（0.01%），線(xiàn)粒體DNA 12S rRNA突變66例（0.34%），SLC26A4基因雜合突變型395例（2.07%），GJB3基因雜合突變62例（0.32%），雙雜合突變型22例（0.11%）。見(jiàn)表2。

2.3耳聾基因和聽(tīng)力篩查結(jié)果

米九每次卸貨的時(shí)候和措姆、登子一起進(jìn)營(yíng)業(yè)部大院。有幾次休息時(shí)，甲洛洛看到米九正用手指頭沾塵土中掉落的幾粒白糖吃，有些時(shí)候給他一個(gè)裝豆瓣的竹條籠子，他高興得像個(gè)孩子，一路舔著竹條上的豆瓣走回家?？杉茁迓宀桓铱隙ㄋ吹降倪@些是否是真的，因?yàn)檫@么多年的經(jīng)驗(yàn)告訴他：表象是最不可靠的。

德國(guó)全自動(dòng)提取樣本DNA，耳聾基因檢測(cè)用博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片試劑盒（24人份）。

2.2地域性結(jié)果

19113例新生兒均進(jìn)行了聽(tīng)力篩查，其中未通過(guò)的有39人，均無(wú)耳聾家族史，其中耳聾基因異常未通過(guò)者有4人，突變類(lèi)型為235de1C純合突變2人、235de1C雜合突變2人。

學(xué)生的思想品德形成過(guò)程中，情感起著“穿針引線(xiàn)”的作用?？梢哉f(shuō)，學(xué)生的情感因素對(duì)整個(gè)教學(xué)活動(dòng)有很大的引導(dǎo)、激勵(lì)、強(qiáng)化作用。因此，在品德課教學(xué)活動(dòng)設(shè)計(jì)時(shí)，教師要更多地設(shè)計(jì)能激發(fā)學(xué)生情感的活動(dòng)，有助于挖掘?qū)W生的內(nèi)心體驗(yàn)，喚起、強(qiáng)化、升華學(xué)生的道德情感，使情理交融，從而促進(jìn)品德內(nèi)化。

3　討論

耳聾是影響人類(lèi)健康的一種常見(jiàn)疾病，也是臨床上常見(jiàn)的遺傳性疾病。研究表明，遺傳性耳聾約占耳聾患者的60%，其中75%-80%為常染色體隱性遺傳，10%-20%為常染色體顯性遺傳，其余為X連鎖和線(xiàn)粒體遺傳等［4］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)遺傳性耳聾人群以GJB2、GJB3、PDS和線(xiàn)粒體12S rRNA基因突變?yōu)橹鳎?-7］。此外，我國(guó)幅員遼闊，各地區(qū)在耳聾基因突變熱點(diǎn)的分布頻率上有一定差異。本研究進(jìn)行的新生兒耳聾基因篩查是長(zhǎng)治市政府組織的惠民工程項(xiàng)目，通過(guò)對(duì)本地區(qū)新生兒進(jìn)行聽(tīng)力篩查和耳聾基因篩查，了解當(dāng)?shù)卣Ｈ巳褐羞z傳性耳聾所占比例及常見(jiàn)耳聾基因突變位點(diǎn)的分布，篩選檢出率較高的致聾突變位點(diǎn)和未見(jiàn)常見(jiàn)耳聾基因突變位點(diǎn)的病例，為減少耳聾患者提供依據(jù)。

當(dāng)今社會(huì)醫(yī)患矛盾異常尖銳，患者對(duì)醫(yī)生的信任與滿(mǎn)意度下降，這與醫(yī)生的素質(zhì)密切相關(guān)。醫(yī)生應(yīng)自覺(jué)成為醫(yī)學(xué)本身規(guī)律和目的的捍衛(wèi)者，積極把握醫(yī)學(xué)發(fā)展方向和速度，努力參與到醫(yī)療體制改革中來(lái)，自覺(jué)抵制過(guò)度追逐名利、過(guò)度依賴(lài)儀器設(shè)備的行為，自覺(jué)追求醫(yī)學(xué)行業(yè)自誕生起便倡導(dǎo)的職業(yè)道德[5]。為了減少醫(yī)患糾紛，醫(yī)學(xué)教育需要從提升醫(yī)學(xué)生職業(yè)素養(yǎng)入手，為社會(huì)輸送具有崇高職業(yè)理想、職業(yè)信念、職業(yè)道德的高素質(zhì)醫(yī)學(xué)人才，將醫(yī)學(xué)生思想政治教育與職業(yè)素養(yǎng)培育相結(jié)合。

本研究采用博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯?九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒對(duì)19113名新生兒的4個(gè)耳聾相關(guān)基因9個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)治地區(qū)正常人群中耳聾基因突變位點(diǎn)以IVS 7-2 A＞G（1.86）和235 del C（1.73%）最多，顯示SLC26A4基因IVS 7-2 A＞G雜合突變和GJB2基因235de1C雜合突變?yōu)楸镜貐^(qū)耳聾基因熱點(diǎn)突變點(diǎn)，與多個(gè)研究中的結(jié)果相一致［8］。

勝利油田直井長(zhǎng)縫壓裂應(yīng)用效果研究………………………………………………………………………………張軍峰（4.17）

長(zhǎng)治地區(qū)13個(gè)縣市區(qū)耳聾基因突變類(lèi)型地域性分布結(jié)果顯示城區(qū)、長(zhǎng)治 縣和襄垣縣突變率居各縣市區(qū)首位，分別為8.26%、5.51%和4.99%。這些地區(qū)呈現(xiàn)高突變率趨勢(shì)的原因，有待于進(jìn)一步研究（環(huán)境污染是否導(dǎo)致遺傳性耳聾突變尚無(wú)定論，如有相關(guān)報(bào)道或考慮相關(guān)性的依據(jù)，可提出）。

研究中我們發(fā)現(xiàn)單純進(jìn)行聽(tīng)力篩查可為耳聾發(fā)病原因提供部分依據(jù)，但像藥物性耳聾突變（即線(xiàn)粒體DNA 12S rRNA突變）和PDS類(lèi)型（即SLC26A4基因雜合突變型）一般的聽(tīng)力篩查并不能檢測(cè)出這些遲發(fā)性耳聾類(lèi)型；由于晶芯?九項(xiàng)遺傳性耳聾基因檢測(cè)試劑盒只檢測(cè)中國(guó)人常見(jiàn)的4個(gè)耳聾相關(guān)基因9個(gè)突變位點(diǎn)，會(huì)出現(xiàn)耳聾基因篩查結(jié)果通過(guò)其聽(tīng)力篩查結(jié)果未通過(guò)的情況。所以進(jìn)行聽(tīng)力和耳聾基因的聯(lián)合篩查可極大地提高新生兒耳聾疾病的檢出率。（未凸顯本研究的意義）。

對(duì)于檢測(cè)出GJB2基因突變而無(wú)其它神經(jīng)及聽(tīng)覺(jué)中樞障礙者，可通過(guò)盡早人工耳蝸植入，提高聽(tīng)力語(yǔ)言康復(fù)效果［9］。對(duì)于可引起大前庭水管綜合征的SLC26A4基因IVS純合突變?nèi)巳?，雖然出生時(shí)可能聽(tīng)力正常，但是在日常生活中需要避免頭部受到碰撞、重?fù)?，以減慢或避免耳聾的發(fā)生。對(duì)于線(xiàn)粒體DNA 12S rRNA突變引起的藥物性耳聾易感者，提供生活指導(dǎo)卡片避免接觸相關(guān)藥物，減少藥物性耳聾發(fā)生。本研究提供的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)將為分析病因，早期干預(yù)，降低本地區(qū)耳聾發(fā)生提供幫助。

表3　長(zhǎng)治市各地區(qū)耳聾基因突變類(lèi)型分布結(jié)果

1韓東一.中國(guó)聾病防治現(xiàn)狀.中華耳科學(xué)雜志，2007，4（5）：345-349.

1劉學(xué)忠，歐陽(yáng)小梅，Yan D，等.中國(guó)人群遺傳性耳聾研究進(jìn)展.中華耳科學(xué)雜志，2006，4（2）：81-89.

2陳煥玲.153例耳聾患者的耳聾基因芯片檢測(cè).吉林：吉林大學(xué).2008.

3王繼，張鐵松.遺傳性耳聾的基因研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述，2013，2（3）：442-444.

4張強(qiáng)偉.129例非綜合征型耳聾患者耳聾基因的篩查.山西：山西醫(yī)科大學(xué).2012.

5戴樸，劉新，于飛，等.18個(gè)省市聾校學(xué)生非綜合征性聾病分子流行病學(xué)研究GJB2 235de1C和線(xiàn)粒體DNA 12SrRNAA1555G突變篩查報(bào)告.中華耳科學(xué)雜志，2006，1（4）：1-5.

6于飛，戴樸，韓東一.GJB2基因突變及語(yǔ)前遺傳性非綜合征性耳聾.國(guó)外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè)，2005，29（6）：359-361.

7戴樸，朱秀輝，袁永一，等.Pendred綜合征基因熱點(diǎn)突變篩查赤峰市聾啞學(xué)校大前庭水管綜合征患者.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41（7）：497-500.

8周怡，劉海紅，郝津生，等.15343例新生兒耳聾基因普遍篩查結(jié)果分析.中國(guó)聽(tīng)力語(yǔ)言康復(fù)科學(xué)雜志，2014，2：109-112.

9戴樸.遺傳性耳聾的預(yù)防與阻斷.中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87（40）：2811-2813.

ChangZhi District 19113 Cases Of Neonatal Deafness Gene Detection

LI Xiaoze，MA Weiping，HU Zhipeng，YAO Zerong，WEI Wei
Changzhi city，Shanxi Province maternal and child health care medical genetic chamber，Changzhi，046000，China Corresponding author：WEI WeiEmail：WeiWei2006_1@126.com

Objective 19113 newborns with deafness gene chip testing whether there is a Chinese common deafness gene abnormality.Methods Gathering on June 6,2013-December 19113 infants born within their respective jurisdictions of changzhi city heel blood and extract DNA,application of deafness gene chip to detect nine four common deafness gene mutations,including GJB2(35 del G,176_191del del 16235 C, 299_300 del AT),GJB3(538 C>T),SLC26A4(IVS,7-2 A>G 2168 A>G)and mitochondrial DNA 12 s rRNA(1555 A>G,1494 C>T).The basic information of 19113 newborns were investigated,including audiology examination.Results 19113 infants were detected deafness gene was abnormal in 984(5.15%),hybrid GJB2 gene mutations among 437 cases(2.29%),235 de1c homozygous mutations in 2 cases(0.01%),12 s rRNA mitochondrial DNA mutation in 66 cases(0.35%),hybrid SLC26A4 gene mutation type 395 cases (2.07%),hybrid GJB3 gene mutation in 62 cases(0.32%),double heterozygous mutations in 22 cases(0.12%). Conclusions Changzhi region newborn common deafness gene mutation is given priority to with GJB2 gene mutations,SLC26A4 gene mutations.Gene mutation rate in the majority with city,changzhi county and xiangyuan county,neonatal deafness gene screening of drug-induced deafness,PDS syndrome detecting a late-onset deafness hearing screening cannot be detected.

The newborn；Deafness genes；Mutation；Gene chip

R764.43

A

1672-2922（2015）03-658-4

2015-10-9審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.020

李曉澤，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主管技師，研究方向：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

魏魏，Email：WeiWei2006_1@126.com