牛紅鑫等

摘要：以殼聚糖為載體固定化胰蛋白酶，制備牡蠣肽，然后以肽得率為指標，分別研究了pH值，酶加量，酶解時間和溫度等單因子對固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白質(zhì)的影響。實驗結(jié)果表明，酶解牡蠣蛋白的最佳工藝條件是：底物濃度為200 μg/mL，加固定化胰蛋白酶量7 mg/3 mL，酶解時間3 h，pH 8.0，溫度40 ℃。在此條件下水解牡蠣蛋白，肽得率可達到20.39%。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；固定化；胰蛋白酶；牡蠣；肽

牡蠣（Crassostrea gigas）是我國重要的養(yǎng)殖貝類品種。牡蠣具有豐富的營養(yǎng)，還有一定的藥用價值。近年的研究表明，牡蠣肽具有多種多樣的生物活性。Wang等利用枯草桿菌蛋白酶從牡蠣中制備的牡蠣肽具有抗氧化活性，經(jīng)過HPLC分離獲得了抗氧化活性牡蠣肽PVMGD和QHGV[1]。其它的還有刺激免疫細胞增加IL-2作用、抑制ACE酶活性以及抗菌活性[2-4]。因此牡蠣肽是一種重要的生物活性物質(zhì)，可以應用于保健食品領(lǐng)域。

酶解法是制備肽的常用方法，固定化酶的方法也是常用的酶解工藝[5]。固定化酶具有可以重復使用、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。本文以肽得率為指標，研究利用殼聚糖固定化胰蛋白酶制備牡蠣肽的最佳工藝條件。研究結(jié)果將為牡蠣肽的制備提供一些有益的數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

牡蠣購于大連長興農(nóng)貿(mào)市場。

胰蛋白酶（1：250）購于北京索萊寶科技有限公司；殼聚糖購于浙江金殼生物化學有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1固定化胰蛋白酶的制備按張金鈴等的方法進行殼聚糖固定胰蛋白酶的制備[5]。在0.2 g殼聚糖上固定了20 mg的胰蛋白酶，活力為314 U。

1.2.2牡蠣肽的制備取新鮮牡蠣，去除內(nèi)臟，加入0.9%的NaCl溶液并進行勻漿，置于4 ℃抽提過夜。在4 000 r/min條件下離心20 min，獲得上清液。

將一定量的殼聚糖固定胰蛋白酶加入到上清液中進行酶解，在不同底物濃度、溫度、pH、加固定化胰蛋白酶量以及時間等條件下，測定肽得率。

1.2.3肽得率測定采用Folin-酚法測定上清液中的蛋白含量。酶解液經(jīng)三氯乙酸（TCA）沉淀后，上清部分用Folin-酚法測定，即是肽的含量。肽得率（%）=上清液肽含量/蛋白含量。

2結(jié)果與討論

2.1不同的殼聚糖固定胰蛋白酶加酶量對牡蠣蛋白酶解反應的影響

在pH8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，分別加入3、4、5、6、7、8 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，測得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著固定化胰蛋白酶量的增加，肽得率逐漸升高，且在固定化胰蛋白酶用量為6 mg/3 mL后，肽得率增加較慢。

2.2pH對牡蠣蛋白酶解反應的影響

在pH分別為5、6、7、8的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，各加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，測得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著pH值的增加，肽得率先升高后降低，且在pH值為8時，肽得率最大。

2.3溫度對牡蠣蛋白酶解反應的影響

在pH 8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，分別于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴酶解4 h，測得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，肽得率先升高后降低，且在溫度值為40 ℃，肽得率最大。

2.4底物濃度對牡蠣蛋白酶解反應的影響

在pH 8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度分別為100、150、200、250、300 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃水浴酶解4 h，測得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著底物濃度的增加，肽得率逐漸升高，且在底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL后，肽得率增加較慢。

2.5酶解時間對菲律賓蛤仔酶解反應的影響

在pH 8.0的3 mL底物質(zhì)量濃度為200 μg/mL的牡蠣蛋白溶液中，加入6 mg固定化胰蛋白酶，于40 ℃分別水浴酶解1、2、3、4、5、6 h，測得的固定化胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著酶解時間的延長，肽得率逐漸升高，且在3 h后，肽得率增加較慢。

2.6殼聚糖固定胰蛋白酶最佳水解條件的確定

影響酶解反應的幾個主要因素為固定化酶量、酶解時間、pH、溫度和底物濃度。根據(jù)上述單因素試驗分析，并考慮生產(chǎn)成本等因素，酶解溫度40 ℃，底物濃度200 μg/mL，以肽得率為指標做殼聚糖固定胰蛋白酶量、pH、酶解時間3因素3水平的正交試驗L9 （33 ），正交試驗的因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

1.32由表2可知，各因素對殼聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律賓蛤仔蛋白的肽得率影響大小順序為A>B>C，即：酶加量>pH>酶解時間，最優(yōu)水平為A3B3C2，即：pH為8.0，殼聚糖固定胰蛋白酶量為7 mg/3 mL，酶解時間3 h。

因此確定殼聚糖固定胰蛋白酶酶解菲律賓蛤仔低分子量蛋白的最佳條件為酶加量7 mg/3 mL，時間3 h，pH 8.0，溫度40 ℃，底物濃度為200 μg/mL。在此條件下水解牡蠣蛋白，肽得率可達到20.39%。

3結(jié)論

殼聚糖固定胰蛋白酶酶解牡蠣蛋白的最佳條件為酶加量7 mg/3 mL，時間3 h，pH 8.0，溫度40 ℃，底物濃度為200 μg/mL。在此條件下水解牡蠣蛋白，肽得率可達到20.39%。

參考文獻：

[1] Wang Q.， Li W.， He Y.， Ren D.， Kow F.， Song L.， Yu X. Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters （Crassostrea talienwhanensis） [J]. Food Chemistry， 2014， 145： 991-996

[2] Achour A.， Lachgar A.， Astgen A.， Chams V.， Bizzini B.， Tapiero H.， Zagury D. Potentialization of IL-2 effects on immune cells by oyster extract （JCOE） in normal and HIV-infected individuals[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 1997， 51（10）： 427-429

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[5] 張金鈴， 遲海， 李偉， 等.殼聚糖固定化胰蛋白酶制備魁蚶肽的研究[J].水產(chǎn)科學， 2010， 29（9）： 553-555