仝其廣 毛雯 張苗苗 張琦 岳志剛 許慧 劉婭 周艷秋 范煜東劉鵬 吳迪 胡大一

臨床研究

吸煙者外周血白細胞膽固醇逆轉運基因表達的變化

仝其廣 毛雯 張苗苗 張琦 岳志剛 許慧 劉婭 周艷秋 范煜東劉鵬 吳迪 胡大一

目的 研究吸煙者外周血白細胞膽固醇逆轉運相關基因表達的狀況，以及不同吸煙水平者基因表達的差異。方法 采用實時熒光定量PCR方法，測定吸煙者和非吸煙者外周血白細胞ABCA1、ABCG1和ApoAI mRNA表達水平。結果 吸煙者ABCA1 mRNA表達水平較對照組顯著降低（0.38±0.11比1.42±0.55，P＜0.05），中重度吸煙者降低較明顯（0.21±0.08 比 1.42±0.55，P＜0.05）。ABCG1 和 ApoAI mRNA 表達水平無顯著降低（4.96±1.65 比 4.28±2.59，P=0.817；0.21±0.09 比 0.69±0.29，P=0.086）。ABCA1 mRNA 表達與吸煙、吸煙量均呈負相關（r=-0.349，P=0.037；r=-0.341，P=0.042）。多元線性回歸分析未見吸煙與ABCA1表達呈獨立相關性（β=-0.516，P=0.591）。結論 吸煙干擾外周血白細胞ABCA1基因表達，并存在劑量效應關系。這可能是吸煙引起動脈粥樣硬化的一個機制。

吸煙； 膽固醇逆轉運； 基因表達

膽固醇逆轉運功能是高密度脂蛋白（HDL）抗動脈粥樣硬化的重要機制，而ABCA1和ABCG1構成了細胞內(nèi)膽固醇流出的關鍵控制因子，ApoA1則是經(jīng)ABCA1旁路膽固醇流出的細胞外主要接受體。吸煙是心血管病的主要危險因素之一。25%～30%的缺血性心臟病死亡可以歸因于吸煙。大量研究顯示，吸煙可誘發(fā)氧化應激、血管炎癥、血小板凝集、血管功能失調和血脂異常（HDL-C降低、總膽固醇和甘油三酯升高）等[1]。吸煙是否影響外周血白細胞ABCA1和ABCG1的表達，這對從分子水平和保護性機制變化方面認識吸煙的致AS作用很有意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇在煤炭總醫(yī)院門診或住院的個體，其中吸煙者21例，男性14例，女性7例，平均年齡（62.14±11.60）歲；不吸煙者 15例，男性 9例，女性6例，平均年齡（66.07±11.70）歲。收集研究對象的基本資料、家族史、既往史、吸煙和飲酒史等。凡有下列情況者予以排除：糖尿病、急性心肌梗死或腦卒中、入院前或體檢前1個月內(nèi)服用他汀或其他降脂藥物、心力衰竭、嚴重肝腎功能損害、血液病、甲狀腺疾病、腫瘤、絕經(jīng)后婦女用激素替代治療。

1.2 研究方法

1.2.1 吸煙分級 按照吸煙量分為不吸煙、輕度吸煙（吸煙支數(shù)＜200支/年）和中重度吸煙（吸煙支數(shù)≥200支/年）。

1.2.2 血清學指標測定 清晨空腹（12 h）取靜脈血。按標準方法測定血脂、血糖、血清肌酐、尿素氮和高敏C反應蛋白（hs-CRP）等生化指標。

1.2.3 外周血白細胞ApoA1 mRNA表達

1.2.3.1 RNA提取 清晨空腹取靜脈血（12 h）2 ml置入EDTA抗凝管內(nèi)，并加入RNA保存液中，-80℃冰箱保存，1周內(nèi)完成RNA提取。按照文獻方法提取外周血白細胞RNA[2]。所有標本RNA均進行純度、濃度和完整性檢驗。

1.2.3.2 基因表達 白細胞總RNA逆轉錄成cDNA。逆轉錄體系（20 μl體系）：RNA 3 μl，5×Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，Oligo（dT）1 μl，逆轉錄酶 0.5 μl，DEPC H2O 10.5μl。逆轉錄程序：42℃保溫60 min。95℃5 min，4℃ 5 min，迅速放入-20℃長期凍存。熒光定量反應（PCR）體系為25μl含：基因組 cDNA 2 μl，上游和下游引物分別為5 pmol，dNTPmix 5 nmol，Taq酶1 U，Taq酶緩沖液2.5μl及滅菌去離子水適量，應用自動循環(huán)儀進行擴增。擴增條件為：預變性94℃ 5 min。反應循環(huán)為：變性94℃ 30 s、退火61℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，循環(huán)35次；最后72℃延伸 10 min?；騧RNA表達以β-actin標化。

引物：β-actin 上游引物 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3′，下游引物 5′-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3′；ApoAI基因，上游引物 5′-CCGCCGTTCTCCTTGAGAG-3′，下游引物 5′-AGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATG-3′ABCA1 基因，上游引物 5′-GGCTGTGTCTCGTATTGTCTG-3′，下游引物 5′-CCTTGTGGCTGGAGTGTCA-3′；ABCG1上游引物 5′-AGAAAGACTTTGAAAGAGTT-3′，下游引物 5′-GGTAAATCACATACTTTGTT-3′。RNA提取和引物合成及熒光定量PCR均由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司負責完成。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，偏態(tài)分布轉化為正態(tài)分布后再進行分析。兩組間比較采用t檢驗或Mann-whitney U檢驗，多組間比較采用ANOVA分析。計數(shù)資料應用χ2檢驗，參數(shù)間單因素相關分析采用Pearson分析，線性回歸用于參數(shù)獨立相關分析。雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 吸煙組與不吸煙組一般臨床資料比較 兩組基礎資料比較顯示，吸煙組飲酒比例明顯高于不吸煙組（P＜0.05）。兩組之間其他基線資料如性別比例、體重指數(shù)、高血壓與冠心病比例比較未見統(tǒng)計學差異。見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較（±s）

表1 兩組一般臨床資料比較（±s）

注：與吸煙組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 年齡（歲） 男/女 體重指數(shù)（kg/m2） 高血壓（%） 冠心?。?） 飲酒（%）吸煙組 21 62.14±11.60 14/7 26.01±5.38 42.9 73.3 38.1不吸煙組 15 66.07±11.70 9/6 26.70±5.18 46.7 71.4 0.0a

2.2 兩組臨床生化指標比較 吸煙組和不吸煙組之間血脂指標比較未見統(tǒng)計學差異（兩組間ApoA1比較接近統(tǒng)計學差異，P=0.065）。兩組肝腎功能指標和血糖水平比較也未見統(tǒng)計學差異。見表2。

2.3 吸煙程度對血脂的影響 隨吸煙量的增加，HDL-C和ApoA1水平呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，中重度吸煙組與不吸煙或輕度吸煙組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 3。

表2 兩組生化指標比較（±s）

表2 兩組生化指標比較（±s）

注：TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；ApoA1：載脂蛋白A1；ApoB：載脂蛋白B；ALT：丙氨酸轉氨酶；BS：空腹血糖；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

Cr（μmol/L）吸煙組 21 4.14±1.63 1.44±0.86 1.24±0.30 2.15±0.90 1.23±0.26 0.91±0.39 18.64±9.72 5.63±0.55 5.02±2.40 64.64±28.22不吸煙組組別 例數(shù) TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）ApoA1（g/L）ApoB（g/L）ALT（U/L）BS（mmol/L）BUN（mmol/L）15 3.50±1.02 1.80±2.04 1.11±0.27 1.91±0.73 1.08±1.19 0.75±0.35 20.10±10.62 5.81±1.36 5.37±1.22 73.00±13.35

表3 不同吸煙程度個體HDL-C和ApoA1水平比較（±s）

表3 不同吸煙程度個體HDL-C和ApoA1水平比較（±s）

注：HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；ApoA1：載脂蛋白A1。與中重度吸煙組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) HDL-C（mmol/L） ApoA1（g/L）不吸煙組 15 1.24±0.30a 1.23±0.26a輕度吸煙組 9 1.22±0.12a 1.14±0.15中重度吸煙組 12 0.99±0.29 1.04±0.22

2.4 吸煙對外周血白細胞膽固醇逆轉運基因mRNA表達的影響 吸煙組ABCA1基因mRNA表達水平較對照組明顯降低（P＜0.05），ABCG1基因表達未見統(tǒng)計學差異，見圖1、2。

圖1 吸煙對外周血白細胞ABCA1 mRNA的影響

圖2 吸煙對外周血白細胞ABCG1 mRNA的影響

進一步按不同吸煙量分析，結果顯示，隨著不吸煙、輕度吸煙和中重度吸煙吸煙量的增加，ABCA1基因mRNA表達水平呈逐漸降低的趨勢，其中不吸煙組和中重度吸煙組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 3。

圖3 吸煙程度對外周血白細胞ABCA1 mRNA的影響

對于ApoA1基因表達而言，吸煙組和對照組之間未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖4。

2.5 吸煙者膽固醇逆轉運基因mRNA表達相關性分析 單因素相關分析顯示，吸煙與ABCA1 mRNA表達呈負相關（r=-0.349，P=0.037），與 ABCG1 表達不相關（r=0.04，P=0.817）；吸煙量與 ABCA1 表達呈負相關（r=-0.341，P=0.042），與 ABCG1 表達不相關（r=0.00，P=0.998）。飲酒與吸煙呈正相關（r=0.452，P=0.006），與 ABCA1 表達無相關性（r=-0.135，P=0.431）。多元線性回歸分析未見吸煙與 ABCA1表達有相關性（β=-0.516，P=0.591）。

3 討論

膽固醇逆轉運（RCT）是HDL抗動脈粥樣硬化發(fā)揮心血管保護作用的重要機制。ABCA1、ABCG1是控制細胞膽固醇流出——RCT第一步的關鍵基因。這些基因功能正常與否對于細胞內(nèi)膽固醇積聚、動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到關鍵調節(jié)作用。

圖4 吸煙對外周血白細胞apoA1 mRNA的影響

吸煙是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一[3]。已發(fā)現(xiàn)，與不吸煙者比較，吸煙者的血清HDL-C水平較低，而停止吸煙后其HDL-C水平可迅速回升[2,4]。本研究也觀察到吸煙者HDL-C濃度呈現(xiàn)減少趨勢，但未見統(tǒng)計學差異。這可能與樣本例數(shù)偏少有關。另外，吸煙者飲酒比例較高，飲酒具有一定程度升高HDL作用，也有可能影響HDL或ApoA1的水平。這些都提示吸煙對于具有血管保護作用的脂蛋白產(chǎn)生負性影響。

研究進一步觀察到，隨著吸煙量增加，HDL-C和ApoA1呈現(xiàn)降低趨勢。最近一項包括近60 000人的大規(guī)模隊列研究同樣顯示，吸煙者HDL-C和ApoA1水平較低，并且吸煙與二者之間呈量效關系，即每日吸煙量越大，HDL-C和ApoA1越低[5]。這種吸煙與血脂指標間的劑量-效應關系也為其他研究所證實[6-8]。HDL和ApoA1將外周組織如動脈壁內(nèi)膽固醇轉運至肝臟代謝排出，是抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，具有心血管保護作用。這從一個方面也說明長期大量吸煙對于心血管的致病性。

吸煙對血脂譜呈現(xiàn)負性作用，損傷膽固醇逆轉運過程的細胞外受體（HDL-C和ApoA1）是否也影響細胞膽固醇流出相關基因表達，從而干擾細胞內(nèi)膽固醇平衡。本研究進一步顯示，外周血白細胞ABCA1 mRNA和ApoA1 mRNA表達減少，并且隨著吸煙量的增加，兩個基因表達都呈進一步降低趨勢。這表明吸煙損害膽固醇逆轉運基因轉錄表達環(huán)節(jié)，并且隨著吸煙量的增加損傷也增加。Li等[9]的研究顯示，男性吸煙者ABCA1 mRNA和ABCG1 mRNA表達較非吸煙男性低。因此，吸煙對控制膽固醇流出基因具有抑制作用。

ABCA1介導膽固醇從巨噬細胞流出至乏脂的ApoA1，而ABCG1介導膽固醇從巨噬細胞流出至成熟的HDL，從而通過ApoA1和HDL將膽固醇從巨噬細胞內(nèi)轉出，轉運至肝臟代謝清除。由此可見，吸煙在基因水平改變膽固醇流出相關基因的表達，有可能促進巨噬細胞水平的膽固醇蓄積，從而促進動脈粥樣硬化的產(chǎn)生與進展。因此，吸煙有可能通過抑制細胞膽固醇流出基因的表達而引起或加重動脈粥樣硬化。

本研究采用人循環(huán)單核白細胞進行基因表達檢測，該類細胞在包括血管壁的外周組織內(nèi)將分化成為巨噬細胞。肝細胞和巨噬細胞是研究RCT的合適標本，但難以應用于人體研究中。據(jù)報道，外周血白細胞RCT的調節(jié)機制與肝臟相似，可以代表肝細胞相關基因[10]。

我們觀察到，兩個RCT相關基因表達與血清HDL-C和apoA1水平無關，這說明外周血白細胞ABCA1 mRNA和apoA1 mRNA基因表達對于血清抗動脈粥樣硬化脂蛋白的產(chǎn)生沒有影響。吸煙導致HDL等脂蛋白水平降低不是通過作用于RCT基因所致。文獻也顯示，單核巨噬細胞ABCA1基因表達對于血漿HDL-C濃度沒有作用，而肝細胞ABCA1等基因表達對血清HDL-C水平產(chǎn)生重要影響[11,12]。

吸煙降低HDL-C的機制仍未完全清楚。吸煙能夠促進兒茶酚胺釋放，由此導致游離脂肪酸增加，從而使VLDL和LDL濃度升高，有利于脂質積聚于血管內(nèi)，引起HDL-C降低[13,14]。吸煙也可增加膽固醇酯轉移蛋白，降低卵磷脂膽固醇乙酰轉移酶活性，影響ApoA1合成或增加TG[15,16]。吸煙影響細胞膽固醇流出基因的機制尚不清楚。體外實驗提示，煙草成分可對人外周血單核細胞免疫或應激相關基因的表達產(chǎn)生影響[17]。人體內(nèi)研究表明，吸煙與外周血單核細胞DNA甲基化有關[18,19]。吸煙如何作用于外周血白細胞ABCA1和ApoA1 mRNA的表達仍需要進一步的探討。

長期大量吸煙可引起血清抗動脈粥樣硬化脂蛋白水平減少及外周血白細胞RCT相關基因表達降低，且吸煙量越大，這種效應越明顯。戒煙后，HDL-C水平可回升。這些都提示吸煙可在血清學水平和分子水平影響動脈粥樣硬化發(fā)生。人們應遠離煙草，以預防動脈粥樣硬化性心血管病的發(fā)生。

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Cholesterol reverse transport gene expression in peripheral blood leukocytes from subjects of smokers

TONG Qi-guang＊，MAO Wen，ZHANG Miao-miao，et al.＊Heart Center，China Meitan General Hospital，Beijing 100028，China

ObjectiveTo investigate cholesterol reverse transport gene expression in peripheral blood leukocytes from smokers and non smokers，and to further analyse the relationship accord to the degree of smoking.MethodsThirty-eight cases were enrolled，peripheral blood leukocytes ABCA1，ABCG1 and ApoAI mRNA expression were measured by real-time quantitative PCR.ResultsABCA1mRNA expression in smokers was obviously less than that in controls（0.38±0.11 vs 1.42±0.55，P＜0.05）.Of which，it was lower for moderate or severe smokers（0.21±0.08 vs 1.42±0.55，P＜0.05）.There were not statistically difference for ABCG1 and ApoAI mRNA expression（4.96±1.65 vs 4.28±2.59，P=0.817，0.21±0.09 vs 0.69±0.29，P=0.086）.Smoking and its amounts were negatively with ABCA1 mRNA expression （r=-0.349，P=0.037，r=-0.341，P=0.042）.Using multivariant linear regression analysis method，it was shown that ABCA1 mRNA expression was not dependly associated with the smoking（β=-0.516，P=0.591）.ConclusionABCA1 mRNA expression in the peripheral blood leukocytes from smokers was inhibited，and it was dose-effect response.It may indicate a mechansim that smoking results in atherosclerosis by this way.

Smoker； Cholesterol reverse transport； Gene expression

首都醫(yī)學發(fā)展科研基金（項目編號：2007-3127）

100028 北京市，煤炭總醫(yī)院心臟中心（仝其廣、毛雯、張苗苗、張琦、范煜東、劉鵬、吳迪），檢驗科（岳志剛、許慧、周艷秋），病案室（劉婭）；北京大學人民醫(yī)院心臟中心（胡大一）

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．08．011

R54

A

1672-5301（2015）08-0715－05

2015-05-15）