袁春平，張文芳，梁華娟，吳志權(quán)

(廣東環(huán)球制藥有限公司，佛山 528305)

吲達(dá)帕胺屬噻嗪類利尿藥，是一種有效的作用強(qiáng)的利尿降壓藥物[1]。該緩釋片治療劑量低，療效明顯，體內(nèi)積蓄少，適合高血壓患者長(zhǎng)期應(yīng)用[2-3]。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，將雜質(zhì)可能帶來的安全性隱患降至最小，本研究建立兩種高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定吲達(dá)帕胺緩釋片的有關(guān)物質(zhì)，方法一采用外標(biāo)法測(cè)定吲達(dá)帕胺緩釋片中4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸(起始原料)，加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)B(脫氫吲達(dá)帕胺，主要的降解雜質(zhì))，并對(duì)其他單雜質(zhì)及總雜質(zhì)進(jìn)行控制;雖然方法一能良好分離雜質(zhì)A(N-亞硝基-2-甲基吲哚啉)，但由于進(jìn)樣量和檢測(cè)限的限制，需建立方法二測(cè)定雜質(zhì)A。報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀;島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器。AL104型、MS105DU型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，分別為萬分之一和十萬分之一天平]。

1.2 試藥 吲達(dá)帕胺緩釋片(廣東環(huán)球制藥有限公司研制，規(guī)格:每片 1.5 mg，批號(hào):110301，110302，110303)，吲達(dá)帕胺對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100257-200903);吲達(dá)帕胺雜質(zhì) B對(duì)照品(USP，批號(hào):1338812)，4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào):SQ5AD-EJ)，吲達(dá)帕胺雜質(zhì)A對(duì)照品(EP，批號(hào):2.1);乙腈、四氫呋喃、冰醋酸、三乙胺為色譜純，超純水為自制，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸和雜質(zhì)B的測(cè)定(方法一)

2.1.1 色譜條件 Welch Ultimate C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:水∶乙腈∶2-丁醇∶三乙胺∶十二烷基硫酸鈉溶液(取十二烷基硫酸鈉5 g，加冰醋酸3 mL，加水100 mL，搖勻)=690∶310∶20∶10∶6(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0);檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm，流速1.6 mL·min－1，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 供試品溶液 取本品適量研細(xì)，取細(xì)粉適量(相當(dāng)于吲達(dá)帕胺15 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙醇適量充分振搖使溶解并稀釋至刻度搖勻。離心，精密量取上清液2 mL，置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.2 供試品-自身對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.3 4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對(duì)照品溶液 取4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對(duì)照品約12.5 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為貯備溶液，精密量取貯備溶液2.4 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 取雜質(zhì)B、4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對(duì)照品各約1.2 mg，精密稱定，置同一個(gè)100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)貯備溶液;另取雜質(zhì)A對(duì)照品約1.2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)A貯備溶液;精密稱取吲達(dá)帕胺對(duì)照品約3 mg，置10 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為吲達(dá)帕胺對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取雜質(zhì)貯備溶液2.4 mL、雜質(zhì)A貯備溶液1 mL、吲達(dá)帕胺對(duì)照品貯備溶液1 mL，置同一個(gè)10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.5 空白輔料溶液 取處方比例的空白輔料適量，精密稱定，加乙醇適量充分振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液2 mL加流動(dòng)相稀釋至5 mL，搖勻，即得。

2.1.2.6 空白溶劑 取乙醇2 mL，置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密量取系統(tǒng)適用性溶液、空白溶劑、4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對(duì)照品溶液、空白輔料溶液、供試品溶液和自身對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，空白溶劑及空白輔料溶液對(duì)有關(guān)物質(zhì)檢查無干擾，吲達(dá)帕胺與已知雜質(zhì)4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸峰、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B分離情況良好。見圖1。

2.1.4 破壞性實(shí)驗(yàn) 取本品研碎，取細(xì)粉適量(相當(dāng)于吲達(dá)帕胺15 mg)，精密稱定，分別通過加入5 mol·L－1鹽酸溶液水浴20 min(破壞后加堿中和至中性)、加入5 mol·L－1氫氧化鈉溶液室溫放置14 h(破壞后加酸中和至中性)、加入30%過氧化氫溶液室溫放置8 h、紫外燈[200 W·h－1·(m2)－1]下14 d 和水浴24 h 的方式進(jìn)行酸性、堿性、氧化、光照和高溫破壞性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見圖2，吲達(dá)帕胺與各種破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)分離情況良好，二極管陣列檢測(cè)器對(duì)吲達(dá)帕胺主峰進(jìn)行峰純度分析，純度因子均在閾值限度之內(nèi)，顯示主峰為單一物質(zhì)。

圖1 6種溶液HPLC色譜圖

圖2 強(qiáng)破壞實(shí)驗(yàn)HPLC圖(方法一)

2.1.5 線性關(guān)系考察及校正因子的測(cè)定 取吲達(dá)帕胺、雜質(zhì)B和4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸峰對(duì)照品各適量，精密稱定，分別用流動(dòng)相依次稀釋制成濃度為1.790～0.030 μg·mL－1，1.005 ～ 0.038 μg·mL－1，1.178 ～0.007 μg·mL－1的6 個(gè)系列溶液，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以兩條線性方程的斜率計(jì)算雜質(zhì)B相對(duì)于吲達(dá)帕胺的校正因子f。為驗(yàn)證校正因子的準(zhǔn)確性，改變實(shí)驗(yàn)儀器、日期、實(shí)驗(yàn)人員，照上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)。由兩次實(shí)驗(yàn)可知，雜質(zhì)B相對(duì)于吲達(dá)帕胺的校正因子f為0.7。4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸的線性方程為Y=34 661X+242.28，r=0.999 9。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào):130101)6份，精密稱定，照“2.1.2”項(xiàng)方法分別制成供試品溶液和自身對(duì)照溶液。在上述色譜條件下測(cè)定，供試品中均未檢出4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸，雜質(zhì)B的平均含量為0.14%，RSD 為0.81%(n=6)。

2.1.7 中間精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(批號(hào):130101)，6份，改變分析日期、人員、設(shè)備，照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制成供試品溶液和自身對(duì)照溶液。在上述色譜條件下測(cè)定。供試品中均未檢出4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸，結(jié)合重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，雜質(zhì)B 的平均含量為0.14%，RSD 為1.00%(n=12)。

2.1.8 定量限和檢測(cè)限 取雜質(zhì)B、吲達(dá)帕胺及4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋制成較濃的貯備液，再用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，分別按10倍和3倍的信噪比計(jì)算其定量限和檢測(cè)限。吲達(dá)帕胺、雜質(zhì)B、4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸的檢測(cè)限分別是 0.20，0.52，0.05 ng，定量限分別是0.58，1.49，0.14 ng。

2.1.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，室溫放置 7 d，分別于0，2，4，6 h 和第 2，3，4，5，6，7 天時(shí)進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果供試品中均未檢出4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸，雜質(zhì)B峰面積的RSD為1.31%，表明供試品溶液在室溫放置7 d穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào):110301)適量(約相當(dāng)于吲達(dá)帕胺15 mg)，9份，精密稱定。分加精密加入雜質(zhì)B貯備液3，6，9 mL，各濃度平行操作3份，照“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，平均回收率為100.7%，RSD=0.72%(n=9);另取4-氯-3-氨磺酰胺苯甲酸儲(chǔ)備液，同法操作，記錄峰面積，平均回收率為97.6%，RSD=1.24%(n=9)。表明本方法準(zhǔn)確性良好。

2.1.11 外標(biāo)法和加校正因子的主成分自身對(duì)照法分別測(cè)定雜質(zhì)B的含量 取不同批次樣品，分別采用雜質(zhì)B對(duì)照品外標(biāo)法和加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行雜質(zhì)B含量檢查，2種測(cè)定方式的結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 吲達(dá)帕胺緩釋片中雜質(zhì)B測(cè)定結(jié)果(方法一) %

2.2 雜質(zhì)A的測(cè)定(方法二)

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry Shield TM C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);以乙腈-四氫呋喃-1.5 g·L－1三乙胺溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8)=(7∶20∶73)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm;柱溫 30℃，流速1.4 mL·min－1，進(jìn)樣量500 μL。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 空白溶劑 取乙腈 5 mL，置 10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.2 空白輔料溶液 稱取處方比例的空白輔料適量(相當(dāng)于主藥量25 mg)精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加乙腈20 mL，充分搖勻，離心，精密量取上清液4 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.3 供試品溶液 取本品細(xì)粉適量(相當(dāng)于吲達(dá)帕胺25 mg)，精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加入乙腈20 mL。密塞，振搖使溶解，離心，取上清液，即得供試品貯備溶液。精密量取供試品貯備溶液4 mL，置10 mL量瓶中，加乙腈1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.2.4 雜質(zhì)A對(duì)照品溶液 取雜質(zhì) A 對(duì)照品1.25 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶，加乙腈溶解并定量稀釋制成每毫升中約含0.125 μg的溶液，即得雜質(zhì)A貯備溶液。精密量取雜質(zhì)A貯備溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得雜質(zhì)A對(duì)照品溶液。

2.2.2.5 混合溶液 精密量取供試品貯備溶液4 mL、雜質(zhì)A貯備溶液1 mL，置同一個(gè)10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 專屬性 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的空白溶劑、空白輔料溶液、供試品溶液、混合溶液、雜質(zhì)A對(duì)照品溶液各500 μL，注入液相色譜儀，色譜圖見圖3，結(jié)果表明混合溶液中吲達(dá)帕胺峰與雜質(zhì)A峰分離度良好，空白溶劑、空白輔料對(duì)樣品中雜質(zhì)A的檢查無干擾。

2.2.4 強(qiáng)破壞實(shí)驗(yàn) 取本品細(xì)粉適量，分別通過加入5 mol·L－1鹽酸溶液水浴20 min(破壞后加堿中和至中性)、加入5 mol·L－1氫氧化鈉溶液室溫放置14 h(破壞后加酸中和至中性)、加入30%過氧化氫溶液室溫放置2 h、紫外燈[200 W·h－1·(m2)－1]下14 d和水浴24 h的方式進(jìn)行酸、堿、氧化、光照和加熱破壞性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示各種破壞下產(chǎn)生的雜質(zhì)與吲達(dá)帕胺分離良好。見圖4。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下雜質(zhì)A 貯備溶液 0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升中含雜質(zhì) A 0.007 6 ～0.025 2 μg的系列濃度對(duì)照品溶液(相當(dāng)于雜質(zhì)含量 15～50 μg·g－1)。分別精密量取500 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程 Y=518.03X+0.055 4，r=0.999 9。

2.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液和混合溶液于室溫條件下放置，在0，2，4，8，24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，供試品溶液中均未檢出雜質(zhì)A，混合溶液中雜質(zhì)A峰面積的RSD為1.59%，表明供試品溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液和混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，供試品溶液中均未檢出雜質(zhì)A，混合溶液中雜質(zhì)A峰面積的RSD為1.48%。改變分析日期、人員、設(shè)備、同法測(cè)定。計(jì)算得雜質(zhì)A峰面積的RSD為1.67%。

圖3 空白溶劑、空白輔料、雜質(zhì)A對(duì)照品、供試品和混合溶液的HPLC圖

圖4 強(qiáng)破壞實(shí)驗(yàn)HPLC圖(方法二)

2.2.8 定量限和檢測(cè)限 取“2.2.2”項(xiàng)下的雜質(zhì)A對(duì)照品溶液，采用逐步稀釋法，分別按10倍和3倍的信噪比計(jì)算其定量限和檢測(cè)限。雜質(zhì)A的定量限為3.0 ng，檢測(cè)限為1.0 ng。

2.2.9 樣品測(cè)定 取中試3批吲達(dá)帕胺緩釋片(批號(hào):110301，110302，110303)，考察長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中雜質(zhì)A的含量變化，結(jié)果見表2。

表2 吲達(dá)帕胺緩釋片中雜質(zhì)A含量測(cè)定結(jié)果(方法二)μg·g－1

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(CP2010)吲達(dá)帕胺片標(biāo)準(zhǔn)[4]有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的色譜條件，流動(dòng)相為甲醇-水-醋酸(45∶55∶0.1)時(shí)不能有效分離已知雜質(zhì)4-氯-3-磺酰胺苯甲酸。經(jīng)考察，《英國(guó)藥典》2010版(BP2010)吲達(dá)帕胺片標(biāo)準(zhǔn)[5]有關(guān)物質(zhì)的流動(dòng)相(水-乙腈-2-丁醇-三乙胺-十二烷基硫酸鈉溶液=690∶310∶20∶10∶6)能有效分離自研制劑的雜質(zhì)和各種破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。

國(guó)內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)中吲達(dá)帕胺制劑有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的供試品處理方法主要有兩種，一是緩釋片研細(xì)混勻后取細(xì)粉溶解，二是直接取整片溶解，振搖2 h。本品經(jīng)兩種方式處理后的檢驗(yàn)結(jié)果無明顯差異，鑒于本品為高分子材料骨架緩釋片，取整片振搖需時(shí)長(zhǎng)，增加雜質(zhì)增長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此選擇第一種處理方法。

BP2010版采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法測(cè)定雜質(zhì)B含量。由于雜質(zhì)B對(duì)照品昂貴且不易獲得，本實(shí)驗(yàn)采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定，方法準(zhǔn)確可行。

BP2010版僅在吲達(dá)帕胺原料中控制雜質(zhì)A的限度(5 μg·g－1)，制劑中并無控制。在自研吲達(dá)帕胺緩釋片穩(wěn)定性研究過程中發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)A的含量隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)有所增加，故建立制劑中雜質(zhì)A的檢測(cè)方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，對(duì)其安全性進(jìn)行控制。方法一中雖然能檢測(cè)到雜質(zhì)A，但由于自研制劑中只有微量雜質(zhì)A，受方法一的進(jìn)樣量和檢測(cè)波長(zhǎng)(240 nm非最大吸收波長(zhǎng))的限制，雜質(zhì) A的內(nèi)控限度上限值(50 μg·g－1)在方法一的測(cè)定條件下不能被檢出，故建立方法二進(jìn)一步控制雜質(zhì)A的量。由于本品的雜質(zhì)A屬于痕量雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用減差法減少測(cè)定的誤差。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的兩個(gè)方法專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確靈敏，能有效分離吲達(dá)帕胺緩釋片中的雜質(zhì)，能在雜質(zhì)譜層面上有效控制雜質(zhì)含量，保證制劑安全、質(zhì)量可控。

[1]胡玉欽，于洋，楊漢煜，等.吲達(dá)帕胺緩釋膠囊生物等效性及藥物動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37(7):483－485.

[2]謝清春，陳燕忠，呂竹芬，等.吲達(dá)帕胺緩釋片的制備及體外釋放度測(cè)定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26(6):561－563.

[3]崔升淼，趙春順，何仲貴.吲達(dá)帕胺緩釋片的研制及釋藥機(jī)理考察[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23(7):397 －399.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:345－346.

[5]British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia[M].London:the Stationary Office Press，2013:3020.