苗 蕊，郭 婧，劉秀萍，張彩虹

卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是致死率最高的婦科惡性疾?。?］。絕大部分卵巢癌患者在確診時已是臨床晚期，70%患者經(jīng)過手術(shù)和化療后腫瘤仍復發(fā)，并且呈現(xiàn)化療耐藥［2］。傳統(tǒng)化療一般選擇細胞毒性藥物最大耐受劑量化療，常規(guī)為6～8個療程，此種化療方案可以有效控制腫瘤。但也會產(chǎn)生多種不良反應，降低患者的生活質(zhì)量，并且殘余腫瘤耐藥性更強［2］。本實驗給予荷人卵巢癌裸鼠順鉑(DDP)最大可耐受劑量化療，療程分別為4和8個，觀察不同化療療程對裸鼠皮下移植瘤生長情況及裸鼠體重的影響，分析不同化療療程對腫瘤增長、耐藥及復發(fā)的影響并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株 人卵巢漿液性癌細胞株SKOV3，購自中科院上海細胞庫。接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于恒溫37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2 實驗動物 雌性Balb/c裸小鼠24只，6～8周齡，體重16～18 g，由中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(軍)2012-0004。在SPF級條件下飼養(yǎng)，所有動物實驗操作過程均遵照國際動物委員會制定的倫理道德規(guī)范。

1.3 模型制備及分組 將1×107個SKOV3細胞接種于裸鼠右側(cè)大腿皮下建立人卵巢癌異種移植瘤模型。移植瘤體積達150～200 mm3時將24只裸鼠隨機分為對照組、短療程化療組和足療程化療組，每組8只。短療程化療組給予DDP 3 mg/kg，腹腔注射，每3天1個療程，共4個療程;足療程化療組給予DDP 3 mg/kg，腹腔注射，每3天1個療程，共8個療程;對照組給予等量生理鹽水，腹腔注射，每3天1個療程，共8個療程。3組均于療程結(jié)束后處死裸鼠取皮下移植瘤組織。

1.4 標本采集 在無菌條件下取出裸鼠皮下移植瘤，移植瘤組織提取總蛋白后保存于－80℃條件下，以備Western blot方法使用。

1.5 主要試劑 Anti-BCRP抗體，購自美國Millipore公司;Anti-LRP1抗體購自美國Abcam公司;Anti-ALDH抗體，購自美國Millipore公司。

1.6 觀察指標 每3天測量裸鼠皮下移植瘤長徑(a)及與其垂直的短徑(b)，根據(jù)體積計算公式:V=1/2ab2計算移植瘤體積;每3天稱量裸鼠體重，并觀察移植瘤組織中干細胞標記物和耐藥相關(guān)蛋白的表達情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，3組及以上比較采用方差分析，組間比較采用LSD法，α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下移植瘤體積變化 化療前3組裸鼠皮下移植瘤體積和體重比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，化療過程中3組裸鼠皮下移植瘤均處于不斷增大狀態(tài)，化療后3組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中短療程化療組和足療程化療組皮下移植瘤體積均小于對照組，且足療程化療組小于短療程化療組(P＜0.01);足療程化療組體重低于對照組及短療程化療組(P＜0.05，P＜0.01)，但短療程化療組裸鼠體重與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 3組裸鼠化療前后皮下移植瘤體積及體重變化情況(±s)

表1 3組裸鼠化療前后皮下移植瘤體積及體重變化情況(±s)

注:與對照組比較，bP＜0.01;與短療程化療組比較，aP＜0.05，dP＜0.01

體重(g)組別 鼠數(shù) 皮下移植瘤體積(mm3)化療前 化療后 化療前 化療后對照組 8 176.00 ±41.58 767.06 ±113.87 21.62 ±0.8520.39 ±2.36短療程化療組 8 187.74 ±55.63 570.68 ±82.45b 20.68 ±2.22 19.50 ±2.85足療程化療組 8 203.10 ±51.51 430.33 ±79.57bd 21.61 ±2.12 17.31 ±1.58ab F＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 0.593 26.308 0.917 3.715 P

2.2 干細胞標記物及耐藥相關(guān)蛋白表達水平 3組裸鼠移植瘤組織中 CD133、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)、P-糖蛋白(P-gp)表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。CD133、BCRP、P-gp表達水平足療程化療組高于對照組及短療程化療組(P＜0.01，P＜0.05)，但短療程化療組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2，圖1。

3 討論

目前卵巢癌的標準一線治療方案是腫瘤細胞減滅術(shù)加術(shù)后含鉑類藥物最大耐受劑量化療6～8個周期［3-5］。DDP足療程化療可以有效抑制腫瘤生長，但是化療藥物的特異性選擇性不強，一些化療毒性反應如惡心嘔吐、骨髓抑制、毛發(fā)脫落等是不可避免的。因此每2個化療周期有1個間歇期，以便正常細胞恢復功能［6］。

Marx［7］認為腫瘤復發(fā)及耐藥是由腫瘤細胞中所占比例極小的腫瘤干細胞(CSC)引起的。Baba等［8］首次把 CD133定義為卵巢癌干細胞標記物。Steg等［9］發(fā)現(xiàn)，在未化療的原發(fā)卵巢癌組織中CD133表達低，化療后CD133表達增加，提示腫瘤干細胞能逃避化療而優(yōu)先存活并導致腫瘤復發(fā)。研究報道，卵巢腫瘤細胞表達CD133是影響預后的一個消極因素［10］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中表達CD133的患者預后不良，其生存期和無病生存期都較短，腫瘤復發(fā)風險更高［10］。有學者認為腫瘤耐藥與ABC轉(zhuǎn)運蛋白在干細胞高水平表達有關(guān)［11］。BCRP、P-gp是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族，它們可以將化療藥物從細胞中“擠出”，從而影響藥物的吸收和分布，改變藥物的療效和毒性。在耐藥細胞中，BCRP在質(zhì)膜中占主導優(yōu)勢［12］，其在質(zhì)膜上形成二聚體，可以將多種無關(guān)物質(zhì)從細胞中“擠出”。徐志宏等［13］提出BCRP、P-gp表達增強與腫瘤細胞的化療反應性差相關(guān)，BCRP的過度表達與腫瘤復發(fā)明顯相關(guān)，在誘導化療藥物介導的獲得性耐藥方面起很大作用。BCRP過度表達的腫瘤細胞對多種化療藥物呈現(xiàn)出抵抗性。

表2 3組裸鼠移植瘤組織中干細胞標記物及耐藥相關(guān)蛋白表達水平(±s)

表2 3組裸鼠移植瘤組織中干細胞標記物及耐藥相關(guān)蛋白表達水平(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與短療程化療組比較，dP＜0.01

分組 鼠數(shù)CD133 BCRP P-gp對照組8 0.26 ±0.09 0.32 ±0.05 0.30 ±0.00短療程化療組 8 0.33 ±0.08 0.34 ±0.03 0.33 ±0.05足療程化療組 8 0.45 ±0.04bd 0.40 ±0.07ad 0.39 ±0.04bd F 12.423 4.446 9.484 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

圖1 3組裸鼠移植瘤中CD133、BCRP、P-gp蛋白表達水平

本研究結(jié)果顯示，對照組裸鼠皮下移植瘤體積最大，短療程化療組次之，足療程化療組移植瘤體積最小，但足療程化療組裸鼠體重低于對照組及短療程化療組。足療程化療組CD133、BCRP、P-gp蛋白表達水平高于對照組和短療程化療組，而短療程化療組與對照組之間比較CD133、BCRP、P-gp蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義。提示，與短療程化療比較，足療程化療抑瘤效果較好，且足療程能使殘余瘤組織中具有部分干細胞特性且耐藥相關(guān)蛋白高度表達的腫瘤細胞富集，可能使復發(fā)腫瘤耐藥性更強，更難治療。

綜上所述，目前常規(guī)使用的6～8個療程足量化療抑瘤效果雖較好，但毒性反應重且復發(fā)腫瘤耐藥性可能更強。

［1］Agarwal R，Kaye S B.Prognostic factors in ovarian cancer:how close are we to a complete picture?［J］.Ann Oncol，2005，16(1):4-6.

［2］Armstrong D K，White A J，Weil S C，et al.Farletuzumab(a monoclonal antibody against folate receptor alpha)in relapsed platinum-sensitive ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2013，129(3):452-458.

［3］Reyners A K，de Munck L，Erdkamp F L，et al.A randomized phase II study investigating the addition of the specific COX-2 inhibitor celecoxib to docetaxel plus carboplatin as first-line chemotherapy for stage IC to IV epithelial ovarian cancer，F(xiàn)allopian tube or primary peritoneal carcinomas:the DoCaCel study［J］.Ann Oncol，2012，23(11):2896-2902.

［4］Vasey P A，Jayson G C，Gordon A，et al.Phase III randomized trial of docetaxel-carboplatin versus paclitaxelcarboplatin as first-line chemotherapy for ovarian carcinoma［J］.J Natl Cancer Inst，2004，96(22):1682-1691.

［5］Coleman R L，Monk B J，Sood A K，et al.Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer［J］.Nat Rev Clin Oncol，2013，10(4):211-224.

［6］Thigpen T，duBois A，McAlpine J，et al.First-line therapy in ovarian cancer trials［J］.Int J Gynecol Cancer，2011，21(4):756-762.

［7］Marx J.Cancer research.Mutant stem cells may seed cancer［J］.Science，2003，301(5638):1308-1310.

［8］Baba T，Convery P A，Matsumura N，et al.Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ovarian cancer cells［J］.Oncogene，2009，28(2):209-218.

［9］Steg A D，Bevis K S，Katre A A，et al.Stem cell pathways contribute to clinical chemoresistance in ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2012，18(3):869-881.

［10］Zhang J，Guo X，Chang D Y，et al.CD133 expression associated with poor prognosis in ovarian cancer［J］.Mod Pathol，2012，25(3):456-464.

［11］Jonker J W，F(xiàn)reeman J，Bolscher E，et al.Contribution of the ABC transporters Bcrp1 and Mdr1a/1b to the side population phenotype in mammary gland and bone marrow of mice［J］.Stem Cells，2005，23(8):1059-1065.

［12］Rocchi E，Khodjakov A，Volk E L，et al.The product of the ABC half-transporter gene ABCG2(BCRP/MXR/ABCP)is expressed in the plasma membrane［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，271(1):42-46.

［13］徐志宏，吳小華，王小玲，等.復發(fā)性卵巢上皮癌干細胞標志物BCRP與相關(guān)因子的表達及其臨床意義［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2009，18(10):743-746.