呂君一潘健于佳霖于洋*（遼寧省沈陽市第二中學(xué)0866；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

黃柏抑菌成分超聲波提取工藝研究

呂君一1潘健2于佳霖2于洋2*
（1遼寧省沈陽市第二中學(xué)110866；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

采用超聲波法提取黃柏中抑菌成分，實驗證明其對西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用。以生長速率法測定抑菌率，通過單因素試驗和正交試驗考察了溶劑濃度、料液比、超聲時間、超聲功率和提取次數(shù)等因素對黃柏提取物抑菌效果的影響，結(jié)果表明，采用85%乙醇作為提取溶劑、料液比為1∶25、超聲時間15min、超聲功率800W、連續(xù)提取2次的提取條件下測得的抑菌率最高、效果最好。

黃柏；西瓜枯萎病菌；分離；抑菌活性

隨著人們環(huán)保意識的日益增強(qiáng)，對高效、低毒農(nóng)藥的需求也日益強(qiáng)烈。植物是自然界中生物活性物質(zhì)的天然寶庫，植物次生代謝產(chǎn)物在提高自身保護(hù)和生存競爭能力及協(xié)調(diào)與環(huán)境的關(guān)系中充當(dāng)著重要角色［1］，如類黃酮、萜烯類、甾體、生物堿、酚類等均具有抗菌或殺蟲活性。植物源農(nóng)藥具有高效、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性、易與其他農(nóng)藥混配等特點，成為目前國內(nèi)外開發(fā)新型生物農(nóng)藥的主要來源之一［2］。黃柏是我國傳統(tǒng)的中藥，為雙子葉植物藥蕓香科植物黃柏或黃皮樹的樹皮［3］，黃柏主產(chǎn)區(qū)在遼寧、吉林、河北、四川、貴外、湖北、云南等地，黃皮樹分布在四川、湖北、貴州、云南、江西、浙江等地。黃柏主要成分為小檗堿、藥根堿、木蘭花堿、黃柏堿、掌葉防己堿等生物堿，及黃柏酮、黃柏內(nèi)醑、7-脫氫豆甾醇、β-谷甾醇、黏液質(zhì)等［4］。相關(guān)研究表明，黃柏提取物可抑制水稻稻瘟病原菌的孢子萌發(fā)［5］；黃柏果實提取物對小麥紋枯病菌和稻紋枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用［6］。黃柏產(chǎn)地豐富、易采集，針對黃柏中具有抑菌活性的化學(xué)成分，建立快速、高效提取分離與篩選鑒定活性物質(zhì)的方法具有重要意義。西瓜枯萎病是生產(chǎn)中重要的土傳病害，目前簡單、快速、有效的藥劑防治法仍是生產(chǎn)上防治該類病害的主要措施。本文報道了黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌活性，并通過單因素、正交試驗確定其最佳提取工藝，旨在為其今后應(yīng)用于植物病蟲害的防治提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

黃柏購自沈陽同仁堂藥房。供試提取溶劑有乙醇、丙酮、乙醇丙酮混合溶劑（乙醇∶丙酮=2∶1）。西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.niveum）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所園藝作物病害與控制研究組提供。

1.2試驗方法

1.2.1黃柏抑菌活性物質(zhì)的制備取粉碎的黃柏10.0g，按料液比加入一定濃度的提取溶劑，用超聲波提取法提取抑菌活性物質(zhì)。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加無菌蒸餾水定容至0.25g/mL，0～4oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抑菌試驗取一定質(zhì)量濃度的黃柏提取液1.0mL，加入9.0mL熱PDA培養(yǎng)基，搖勻，對照組中加入等量無菌水，倒入融化的PDA培養(yǎng)基至10.0mL，搖勻，制成平板。接種生長一致的供試菌菌餅（Φ= 6.0mm），使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，25℃下培養(yǎng)，分別于第4d、第7d用十字交叉法測量菌落生長直徑。抑菌試驗共2個處理（培養(yǎng)基加提取液和培養(yǎng)基加無菌水），每處理3次重復(fù)。菌落生長直徑（mm）=菌落直徑平均值-6.0mm；菌絲生長抑制率（%）=［（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑］×100。

1.2.3提取工藝的優(yōu)化以抑菌率為考察指標(biāo)，單因素試驗乙醇濃度、料液比、超聲波時間、超聲波功率等因素對黃柏有效抑菌成分提取率的影響，數(shù)據(jù)分析利用SPSS11.5。結(jié)合單因素試驗，選擇乙醇濃度、料液比、回流時間、提取功率為影響因素，采用L9（34）正交試驗表設(shè)計正交試驗（見表1），優(yōu)化黃柏有效抑制西瓜枯萎病菌成分的最佳提取工藝。

1.2.4最佳提取工藝的驗證試驗選定西瓜枯萎病進(jìn)行離體抑菌試驗，驗證黃柏抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝。

表1　正交試驗因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1黃柏不同溶劑提取物對西瓜枯萎病菌的抑制作用

乙醇、丙酮、乙醇丙酮混合液等3種溶劑的黃柏提取物對西瓜枯萎病菌菌絲生長均有一定的抑制作用（見表2）。其中，70%乙醇提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌效果均較好，確定乙醇為提取溶劑。

表2　不同溶劑提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.2黃柏乙醇提取物使用濃度的確定

隨著黃柏提取物濃度的降低，抑菌率明顯降低（見表3）。黃柏乙醇提取物質(zhì)量濃度為2.00g/mL時，抑菌效果最好，但抑菌率過高不利于最佳提取條件試驗的確定，為了后期試驗有序進(jìn)行，故選擇0.25g/mL為后續(xù)試驗濃度。

表3　不同濃度的黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3單因素試驗

2.3.1乙醇濃度對黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入料液比為1∶20的不同濃度乙醇，在提取溫度40℃、超聲功率800w的條件下提取40min，提取2次。由表4可知，乙醇濃度為80%時，黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳。

2.3.2料液比對黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入不同料液比的80%乙醇，在提取溫度40℃、超聲功率800w的條件下提取40min，提取2次。由表5可知，當(dāng)料液比為1∶20時，黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳。

表4　不同乙醇濃度的提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

表5　不同料液比的提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3.3超聲波時間對黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入料液比為1∶20的80%乙醇，在提取溫度40℃、超聲功率800w的條件下提取40min，提取2次。由表6可知，超聲波時間為20min和40min時，黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌效果均較好，且差異不顯著（p<0.05），故選取超聲時間為20min。

表6　不同超聲波時間的提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.3.4超聲波功率對黃柏提取物抑菌效果的影響取黃柏粉末10.0g，加入料液比為1∶20的80%乙醇，在提取溫度40℃、不同超聲功率下提取20min，提取2次。由表7可知，當(dāng)超聲波功率為800w時，黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌效果最好。

表7　不同超聲波功率的提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

2.4對西瓜枯萎病菌抑菌效果的正交試驗

由極差分析可以看出（見表8），針對西瓜枯萎病菌，各因素影響黃柏抑菌活性物質(zhì)抑菌效果的主次順序為：乙醇濃度、料液比、超聲波功率、超聲波時間，即乙醇濃度影響最大，超聲波時間影響較小。針對西瓜枯萎病菌提取黃柏抑菌活性物質(zhì)的最佳提取工藝為A3B3C1D2，即乙醇濃度為85%、料液比為1∶25、超聲時間為15min、超聲功率為800w。

表8　L9（34）對西瓜枯萎病菌抑菌作用的正交試驗

2.5驗證試驗

比較單因素最佳組合提取工藝與上述3種提取工藝的抑菌效果。由表9可知，提取工藝A3B3C1D2的黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的4d、7d抑菌效果最佳，確定黃柏抑菌成分的最佳提取工藝為A3B3C1D2，即85%乙醇濃度、料液比為1∶25、超聲時間為15min、超聲功率為800w。

表93　種提取工藝的提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌率

3　討論與結(jié)論

近年來，從天然資源中尋找抗菌、殺蟲活性物質(zhì)代替化學(xué)農(nóng)藥已成為植物保護(hù)研究中的熱點。我國有豐富的中草藥資源，是開發(fā)植物源抗菌劑的理想來源?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已表明，黃柏具有抗病原微生物、抗炎、抗?jié)?、降壓、抗心律失常、解熱等作用?～8］，但關(guān)于黃柏在抗植物病原菌方面的研究及應(yīng)用還少見報道。

本試驗確定了黃柏的乙醇提取物對西瓜枯萎病菌的菌絲生長均具有較強(qiáng)的抑制作用，但其具體的抑菌作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。同時，通過單因素試驗和正交試驗確定超聲波提取法提取黃柏抑菌活性物質(zhì)的最佳條件為：以85%乙醇作為提取溶劑、料液比1∶25、超聲時間15min、超聲功率800w、連續(xù)提取2次。本研究針對黃柏提取物對西瓜枯萎病菌的抑菌活性及其提取方法方面進(jìn)行了初步探索，為深入研究其抗菌活性成分，以及植物源殺菌劑和黃柏資源的開發(fā)與利用提供依據(jù)。

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