范琳，王少君，李坤蘭

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咪唑類離子液體在纖維素酶降解纖維素體系中的作用

范琳，王少君，李坤蘭

（大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

以1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯（[Emim]DEP）、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸（[Emim]Ac）為研究對(duì)象，考察兩種離子液體（IL）對(duì)酶法降解纖維素過(guò)程的影響。采用超聲輔助離子液體溶解纖維素，[Emim]DEP和[Emim]Ac分別使纖維素的結(jié)晶度降為53.6%和62.3%。在纖維素酶降解再生纖維素的過(guò)程中，當(dāng)IL的加入量小于2.0%時(shí)，對(duì)酶解過(guò)程起促進(jìn)作用，其中加入量為0.5%時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)，酶解率分別提高了11.4%和17.5%。在最優(yōu)條件下（加入0.5%IL），測(cè)量纖維素酶系中各個(gè)酶的酶活，結(jié)果表明離子液體對(duì)β-葡萄糖苷酶起到了明顯的促進(jìn)作用，分別使該酶酶活提高了120%和87%。離子液體降低了纖維二糖對(duì)葡聚糖外切酶的抑制作用，提高了酶解效率。

離子液體；纖維素；纖維素酶；溶解；降解

引 言

纖維素的綠色降解工藝是在纖維素酶作用下的酶解反應(yīng)，但是由于纖維素分子間與分子內(nèi)氫鍵的大量存在，結(jié)晶度較高，不溶于水和普通有機(jī)溶劑，限制了纖維素的基礎(chǔ)研究和工業(yè)應(yīng)用。研究表明，離子液體可以溶解纖維素，降低其結(jié)晶度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高效酶解反應(yīng)得到葡萄糖[1]。葡萄糖可以轉(zhuǎn)化成乙醇、丙酮、丁醇等燃料和化工原料，這對(duì)于解決目前的能源危機(jī)問(wèn)題具有重要意義[2-3]。本研究應(yīng)用1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯（[Emim]DEP）、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸([Emim]Ac)兩種離子液體，借助超聲輔助分別將纖維素溶解，用纖維素酶降解再生后的纖維素，采用DNS比色法，通過(guò)測(cè)量在降解體系中加入不同量的離子液體時(shí)體系中還原糖的濃度來(lái)反映離子液體對(duì)降解體系的影響，歸納總結(jié)出離子液體對(duì)纖維素酶混合酶系中各個(gè)酶的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

微晶纖維素（結(jié)晶度為80.6%），美國(guó)FMC。纖維素酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。[Emim]Ac[4]、[Emim]DEP[4]、DNS[5]等試劑均為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

D/Max-3B型X射線衍射儀，日立Hitachi公司；JEOL JSM-6460LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；ACE超聲化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)，美國(guó)Sonics公司；12-POLS型偏光顯微鏡，日本Olympus公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素的溶解及再生 將微晶纖維素和離子液體以1:20的比例置于超聲瓶中混合，在超聲輔助條件下（探頭溫度90℃，功率40%，循環(huán)水溫度70℃）充分溶解3 h[6]。溶解完全后，加入適量去離子水，反復(fù)沖洗沉降后得到再生纖維素，冷凍干燥24h，待用[7]。以偏光顯微鏡、X射線衍射儀（XRD）等儀器，從形貌、晶型狀態(tài)等方面描述纖維素溶解變化過(guò)程。

1.3.2 纖維素的酶解 配制100ml HAc-NaAc緩沖溶液[8]，加入1 g纖維素酶制成酶液待用。取40 ml酶液，先后加入0.1 g纖維素和不同濃度的離子液體。在50℃、120 r·min-1條件下反應(yīng)8 h后離心得上清液。采用DNS法測(cè)定上清液中還原糖含量[9]，進(jìn)而計(jì)算出酶解率。

1.3.3 酶活的測(cè)定 按照國(guó)際理論應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)（IUPAC）推薦的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法分別測(cè)定纖維素總酶活（濾紙酶活）、葡聚糖內(nèi)切酶酶活、葡聚糖外切酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活[10]。在4個(gè)100ml錐形瓶中分別加入40 ml纖維素酶液、底物（1 cm× 6 cm whatman No.1濾紙條，1%羧甲基纖維素鈉，1%微晶纖維素，1%水楊苷）、0.5%離子液體（[Emim]Ac、[Emim]DEP）。置于50℃的恒溫水浴振蕩反應(yīng)器中，120 r·min-1恒溫反應(yīng)60 min。用20 ml滅活的纖維素酶液作空白，采用DNS法測(cè)定體系中還原糖的含量，進(jìn)而計(jì)算出酶活。

1.4 計(jì)算公式

結(jié)晶指數(shù)[11]計(jì)算公式為

式中，200為222.7°處的峰值；AM為218°處的峰值。

酶解率[12]計(jì)算公式為

式中，為還原糖的質(zhì)量，g；為纖維素的質(zhì)量，g；為纖維素的含水率，%。

纖維素酶活的定義：在特定條件下，單位質(zhì)量的酶每分鐘催化相應(yīng)的底物纖維素水解成l μmol葡萄糖，稱為一個(gè)酶活單位即1 U·g-1[12]。計(jì)算公 式為

酶活（U·g-1）(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素的溶解

2.1.1 偏光顯微鏡分析 由圖1、圖2可知，在超聲輔助條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素在兩種離子液體中逐漸溶解，3 h后，纖維素完全溶解。在相同時(shí)間，[Emim]Ac體系在偏光鏡下更明亮，說(shuō)明未溶解的部分更多，因此，[Emim]DEP比[Emim]Ac溶解纖維素的能力更強(qiáng)。

2.1.2 XRD分析 由圖3可知，對(duì)于未處理纖維素，其結(jié)晶程度大，衍射峰尖銳，屬于典型的纖維素Ⅰ型[13]。經(jīng)兩種離子液體處理后，峰形不再尖銳明顯，而是變成一組強(qiáng)度很低分布很寬的衍射峰，這與纖維素Ⅱ型相符，說(shuō)明離子液體處理后纖維素的結(jié)構(gòu)由Ⅰ型轉(zhuǎn)變成了Ⅱ型[14-15]。并且，經(jīng)[Emim]DEP處理后的纖維素衍射峰比[Emim]Ac更平滑、分布更寬，進(jìn)一步說(shuō)明[Emim]DEP溶解纖維素的能力更強(qiáng)。

2.1.3 結(jié)晶指數(shù)分析 由表1可知，經(jīng)兩種離子液體處理后，纖維素的結(jié)晶指數(shù)大大降低，為后來(lái)纖維素酶解提供更多更好的作用位點(diǎn)，有利于下一步酶解反應(yīng)的進(jìn)行。

2.1.4 再生率分析 分別用[Emim]DEP和[Emim]Ac兩種離子液體溶解1 g微晶纖維素，經(jīng)反復(fù)沖洗、沉降、過(guò)濾、干燥后可以得到0.88 g和0.93 g的再

圖3 [Emim]Ac和[Emim]DEP處理前后纖維素的XRD譜圖

表1 不同離子液體處理前后纖維素結(jié)晶指數(shù)的變化

生纖維素，再生率分別為88%和93%。說(shuō)明部分被溶解的纖維素?zé)o法全部再生，經(jīng)[Emim]Ac處理的纖維素再生率比[Emim]DEP高，進(jìn)一步說(shuō)明[Emim]DEP溶解纖維素的能力比[Emim]Ac更強(qiáng)。

2.2 纖維素的酶解

利用溶解效果相對(duì)較好的[Emim]DEP處理微晶纖維素，反復(fù)沖洗沉降后得到結(jié)晶指數(shù)均為53.6%的再生纖維素，準(zhǔn)確稱取13份質(zhì)量為0.1g的再生纖維素，加入酶液和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的兩種離子液體，結(jié)果如圖4所示。隨著兩種離子液體加入量的增加，酶解率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。加入量小于2.0%時(shí)，離子液體對(duì)酶解過(guò)程起促進(jìn)作用。其中，加入量為0.5%時(shí)，對(duì)酶解過(guò)程的促進(jìn)作用最強(qiáng)，[Emim]Ac和[Emim]DEP分別可以使酶解率提高11.4%和17.5%，且在相同加入量條件下，[Emim]DEP對(duì)酶解過(guò)程的促進(jìn)作用強(qiáng)于[Emim]Ac。

2.3 離子液體對(duì)纖維素酶系中各個(gè)酶的作用與分析

由圖5可以看出，當(dāng)分別向纖維素的酶解體系中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的兩種離子液體時(shí)，纖維素酶的總酶活都有所提高。[Emim]Ac和[Emim]DEP分別使β-葡萄糖苷酶的酶活提高了87%和120%，使葡聚糖外切酶的酶活提高了39%和51%，而加入離子液體對(duì)于葡聚糖內(nèi)切酶的影響不大。其中，

圖4 加入不同量的IL時(shí)纖維素的酶解情況

圖5 加入0.5%IL時(shí)纖維素酶系中各個(gè)酶的酶活

[Emim]DEP對(duì)纖維素酶系中3種酶的促進(jìn)作用強(qiáng)于[Emim]Ac。

纖維素酶是由多種酶混合組成的，具有協(xié)同作用的復(fù)雜酶系，根據(jù)酶功能的不同，纖維素酶主要分為3種組分：葡聚糖內(nèi)切酶(EC)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(BG)[16]。其中，葡聚糖內(nèi)切酶主要作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)切斷纖維素長(zhǎng)鏈的β-1,4-糖苷鍵，生成纖維寡糖、纖維三糖或纖維二糖等長(zhǎng)度不等的短鏈低聚糖。葡聚糖外切酶由催化域（CD）和吸附域（CBD）兩部分構(gòu) 成[17]，主要作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，可破壞其結(jié)晶結(jié)構(gòu)并從纖維素長(zhǎng)鏈的非還原端逐一水解出纖維二糖。β-葡萄糖苷酶主要用于水解反應(yīng)中生成的纖維二糖，使其最終變?yōu)槠咸烟荹18]。

在整個(gè)降解的過(guò)程中，由于CBH的活性中心呈狹長(zhǎng)的隧道狀深陷于催化域的內(nèi)部，只有單鏈纖維素分子能夠進(jìn)入。CBD具有吸附在纖維素表面并從結(jié)晶纖維素表面分離出纖維素單鏈的作用，所以CBD能否在酶解過(guò)程中高效地進(jìn)行吸附分離作用是提高纖維素酶降解纖維素速率的決定因素[19]。然而，當(dāng)生成的纖維二糖不能被及時(shí)分解時(shí)，大量的纖維素二糖會(huì)吸附在CBH上，使酶分子構(gòu)像發(fā)生變化，CBD無(wú)法進(jìn)行有效吸附，致使CD缺少底物而不能發(fā)生作用[20]。另外纖維二糖在活性中心附近與色氨酸結(jié)合產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，阻塞了狹窄的活性中心隧道，使單根纖維素分子鏈難以進(jìn)入發(fā)生水解作用[21]。有研究表明[22]，當(dāng)CBH吸附微晶纖維素時(shí)，表現(xiàn)為分子間氫鍵強(qiáng)度的減弱。CBH的吸附并未影響天然纖維素的指紋區(qū)各譜帶形狀、位置和強(qiáng)度的變化，表明吸附只涉及纖維的表面而未影響CC，CO等纖維素分子骨架的結(jié)構(gòu)，但它可導(dǎo)致微纖維束和基元纖維的分離，這是分子鏈間氫鍵結(jié)合力減弱的結(jié)果，可為水解作用的進(jìn)行提供條件。但是CBH與纖維二糖結(jié)合后，再吸附微晶纖維素時(shí)，卻導(dǎo)致了與上述完全不同的變化，纖維素氫鍵區(qū)的吸收強(qiáng)度反而增強(qiáng)，微纖維束和基元纖維無(wú)法分離，而游離的基元纖維的存在是纖維素酶完成催化水解作用的必需條件，因此水解過(guò)程受到抑制。當(dāng)在水解體系中加入一定濃度的離子液體時(shí)，離子液體中的陰離子充當(dāng)電子給予體，陽(yáng)離子充當(dāng)電子接受體，與纖維素中H原子和O原子相互作用，降低纖維素分子間的氫鍵強(qiáng)度，減輕體系中纖維二糖對(duì)CBH的反饋抑制作用，提高β-葡萄糖苷酶的酶活，使吸附催化過(guò)程高效進(jìn)行，進(jìn)而提高了酶解效率。含有不同陰離子的咪唑類離子液體破壞纖維素中氫鍵的能力不同，提高酶解率的效果也就不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，[Emim]DEP對(duì)纖維素酶解過(guò)程的促進(jìn)作用強(qiáng)于[Emim]Ac。

3 結(jié) 論

（1）采用超聲輔助方法，從形貌上（偏光顯微鏡）、晶型（XRD）上研究了兩種離子液體[Emim]DEP和[Emim]A對(duì)纖維素溶解過(guò)程的影響，證明離子液體對(duì)溶解過(guò)程起到促進(jìn)的作用，分別使纖維素的結(jié)晶度降為53.6%和62.3%。

（2）研究了IL加入量對(duì)纖維素酶降解再生纖維素過(guò)程的影響，發(fā)現(xiàn)隨著IL加入量的增加，酶解率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在加入量為0.5%時(shí)，促進(jìn)作用最強(qiáng)，酶解率分別提高了11.4%和17.5%。且加入量小于2.0%時(shí)，IL對(duì)酶解過(guò)程起促進(jìn)作用，加入量大于2.0%時(shí)，酶解率趨于平緩。

（3）在最優(yōu)條件下（加入0.5%IL），測(cè)量纖維素酶系中各個(gè)酶的酶活，結(jié)果表明離子液體對(duì)β-葡萄糖苷酶起到了明顯的促進(jìn)作用，分別使該酶酶活提高了120%和87%。離子液體通過(guò)提高β-葡萄糖苷酶的酶活使過(guò)量的纖維二糖及時(shí)水解為葡萄糖，減輕體系中纖維二糖對(duì)CBH的反饋抑制作用，使吸附催化過(guò)程高效進(jìn)行，進(jìn)而提高了酶解效率。

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Function of imidazolium-based ionic liquids in system of enzymatic
degradation of cellulose

FAN Lin, WANG Shaojun, LI Kunlan

(School of Light Industry & Chemical Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, Liaoning, China)

Taking 1-ethyl-3-methylimidazolium diethyl phosphate ([Emim]DEP) and 1-ethyl-3-methylimidazolium acetate ([Emim]Ac) as research targets, the influence of the two ionic liquids (IL) on the process of enzymatic degradation of cellulose was investigated. By using ultrasound to assist ionic liquids in dissolving cellulose, [Emim]DEP and [Emim]Ac made the crystallinity of cellulose decrease to 53.6% and 62.3% respectively. In the process of enzymatic degradation of regenerated cellulose, when the dosage of IL was less than 2.0%, IL acted as promoter, and when the dosage of IL was 0.5%, the promoting effect of IL was the strongest. Enzymatic hydrolysis rate increased by 11.4% and 17.5% respectively. Under the optimal conditions (add in 0.5% IL), the enzyme activities of every enzyme in the cellulose system were measured. Ionic liquids had an obvious promoting effect on β-glucosidase, increasing enzyme activity by 120% and 87% respectively. Ionic liquids reduced inhibition of exoglucanase by cellubiose, and improved efficiency of enzymatic degradation of cellulose.

ionic liquids; cellulose; cellulase; dissolution; degradation

date: 2014-07-15.

Prof. WANG Shaojun, wgsoju@163.com

10.11949/j.issn.0438-1157.20141062

TQ 352.2

A

0438—1157（2015）01—0121—05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21106011）。

2014-07-15收到初稿，2014-09-22收到修改稿。

聯(lián)系人：王少君。第一作者：范琳（1989—），女，碩士研究生。

supported by the National Natural Science Foundation of China (21106011).