朱 瑾 夏春鳳 李艷菊 馬國(guó)詔 段瑞生 朱梅佳

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250021)

過度氧化應(yīng)激與自由基毒性作用在AD的發(fā)病中起著重要作用。Aβ產(chǎn)生大量的自由基，可直接氧化酶蛋白氨基酸殘基，使酶失活，影響Na+-K+-ATP酶活性，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Na+的聚集，K+的流失，細(xì)胞的離子失衡，內(nèi)環(huán)境的紊亂。已有研究表明單唾液酸四已節(jié)苷脂(GM1)可以通過維持中樞神經(jīng)細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶的活性〔1～4〕，起到維持細(xì)胞內(nèi)外離子平衡、減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫、防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+聚集的作用;還可以對(duì)抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用，減少自由基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害，起到神經(jīng)保護(hù)作用。而ATP敏感鉀通道(ATP，KATP通道)開放藥物二氮嗪可降低Aβ寡聚體聚集，用二氮嗪預(yù)處理能夠抵抗Aβ1～42的神經(jīng)毒性〔5〕。但二氮嗪的預(yù)處理是否影響Aβ對(duì)Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白的表達(dá)，目前尚未報(bào)道。因此，本研究旨在探討Aβ1～42及二氮嗪預(yù)干預(yù)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Wistar種系的大乳鼠(出生24 h內(nèi))，雌雄不限，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;Aβ1～42、二氮嗪、多聚賴氨酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清、B27 supplement及Neurobasal培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自?？寺」?Na+-K+-ATP酶β亞基抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;DyLight 488，山羊抗鼠 IgG購(gòu)自Abbkine公司;山羊抗鼠IgG/辣根酶標(biāo)記購(gòu)自中杉公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠皮層海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 選用Wsitar大鼠新生24 h的胎鼠，75%酒精消毒，在無菌條件下，用顯微鑷子分離出大腦皮層及海馬置于D-Hank液中，剝除腦膜，然后將腦組織剪成碎塊，0.125%胰酶(37℃)消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打均勻后200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，1000 r/min離心10 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，吸管吹打成單細(xì)胞懸液，加到多聚賴氨酸包被的12孔板，接種密度6×105個(gè)/ml，培養(yǎng)皿的接種密度 2×106個(gè)/ml，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，第二天換含2%B27 supplement的Neurobasal的培養(yǎng)液，以后每2 d換液1次，第7天加藥處理。

1.2.2 分組及藥物處理 Aβ1～42人工重組蛋白質(zhì)0.1 mg，溶于 10 μl DMSO 中，再用 100 μl磷酸鹽緩沖液稀釋(pH7.4)，配成濃度為221 μmol/L，即為原液。將原液置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育48 h進(jìn)行老化處理，4℃?zhèn)溆?。二氮?2 mg)溶于200 μl的DMSO中，終濃度為1 mmol/L，4℃?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)分為四組:空白對(duì)照組、單獨(dú) Aβ1～42干預(yù)組、二氮嗪預(yù)處理 1 h 后 Aβ1～42干預(yù)組、單純二氮嗪預(yù)處理組，每組又分為24 h及72 h兩個(gè)亞組。細(xì)胞培養(yǎng)第7天，二氮嗪預(yù)處理1 h后Aβ1～42干預(yù)組加入二氮嗪(50 μmol/L)預(yù)處理 1h 后加入 Aβ1～42(2 μmol/L)作用;單獨(dú)Aβ1～42干預(yù)組加入等量的磷酸鹽緩沖液預(yù)處理1 h后，加入等量Aβ1～42;單獨(dú)二氮嗪預(yù)處理組為加入二氮嗪預(yù)處理1 h后加入等量培養(yǎng)液;對(duì)照組加等量磷酸鹽緩沖液和培養(yǎng)液。分別在孵育24、72 h后進(jìn)行免疫熒光及免疫印跡檢測(cè)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)各組Na+-K+-ATP酶β亞基的蛋白表達(dá)培養(yǎng)加藥后的細(xì)胞爬片，用4%的多聚甲醛固定15 min，0.2%Triton孵育30 min，用封閉液室溫封閉60 min，去封閉液后加入稀釋的鼠抗大鼠Na+-K+-ATP酶β亞基抗體一抗(1∶50)4℃過夜，次日磷酸鹽緩沖液(PBST)洗3×5 min，加二抗室溫60 min，PBST 洗3×5 min，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核后防熒光淬滅封片劑封片，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.2.4 Western印跡檢測(cè)各組Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白的表達(dá) Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞24 h及72 h后提取細(xì)胞并用PBS洗滌3次后晾干，加入適量的蛋白裂能液(RIPA)裂解液苯甲基磺酰氟溶液(PMSF)(100∶1)冰浴中裂解細(xì)胞，刮勺收集細(xì)胞，4℃離心后，一組進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，另一組加1/3的loading buffer(4×)，100℃水浴10 min，－80℃凍存。次日灌膠，取相應(yīng)蛋白量上樣，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗稀釋液，鼠抗大鼠Na+-K+-ATP酶β亞基抗體一抗(1∶100)于4℃孵育過夜，次日用TBST緩沖液洗3×10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體)于室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗3×10 min，加入發(fā)光劑(ECL)顯色，以β-actin作為內(nèi)參，用圖像分析軟件Band Scan進(jìn)行光密度積分值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行單因素方差。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)24 h、72 h、神經(jīng)細(xì)胞Na+-K+-ATP酶β亞基熒光強(qiáng)度 單獨(dú)Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞24 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基熒光染色強(qiáng)度較對(duì)照組沒有明顯改變;經(jīng)二氮嗪預(yù)處理后Aβ1～42作用24 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基的熒光染色強(qiáng)度也沒有明顯改變。單獨(dú)Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞72 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基熒光染色強(qiáng)度較對(duì)照組顯著降低;經(jīng)二氮嗪預(yù)處理后Aβ1～42作用72 h后，與單獨(dú)Aβ1～42干預(yù)組相比較有所增強(qiáng);單獨(dú)二氮嗪干預(yù)組Na+-K+-ATP酶β亞基熒光染色強(qiáng)度與對(duì)照組和Aβ1～42+二氮嗪組沒有明顯改變。見圖1。

圖1 免疫熒光染色觀察各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、72 h后Na+-K+-ATP酶β亞基熒光強(qiáng)度變化(×400)

2.2 蛋白電泳檢測(cè)24 h、72 h神經(jīng)細(xì)胞Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)變化 單獨(dú)Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞24 h后，Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較沒有明顯改變;二氮嗪預(yù)處理神經(jīng)細(xì)胞1 h協(xié)同Aβ1～42作用24 h后及單獨(dú)二氮嗪組Na+-K+-ATP酶β亞基的蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組及單獨(dú)Aβ1～42組(P＜0.01)。單獨(dú)Aβ1～42作用72 h后，Na+-K+-ATP酶 β 亞基蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低(P＜0.05);二氮嗪預(yù)處理1 h協(xié)同Aβ1～42共同作用72 h后，與單獨(dú)Aβ1～42干預(yù)組相比，增加了Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)量(P＜0.05);單獨(dú)二氮嗪干預(yù)組Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)明顯低于以上各組(P＜0.01)。見圖2。

圖2 免疫印跡檢測(cè)各組處理24 h、72 h Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)的變化

3 討論

老年炎性斑內(nèi)的大量Aβ沉積在AD發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。而Aβ的神經(jīng)毒性機(jī)制也極其復(fù)雜，與過度氧化應(yīng)激、Ca2+的超載、谷氨酸濃度的增高等有著一定的關(guān)系。

本研究提示Aβ對(duì)Na+-K+-ATP酶β亞基有影響，其機(jī)制可能與啟動(dòng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)〔6〕。Aβ本身或通過多種途徑可以產(chǎn)生、誘導(dǎo)活性氧(ROS)，使神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中自由基濃度升高，它的增加使脂質(zhì)過氧化，形成脂質(zhì)過氧化物，蛋白被氧化修飾，線粒體功能失調(diào)〔7〕，使有氧呼吸鏈電子傳遞形成短路，減少ATP生成;還可經(jīng)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的作用，使細(xì)胞膜受到損害〔8〕，繼而影響ATP酶，使其活性下降。谷胱甘肽(GSH)在抗氧化物及自由基的損傷中有重要作用，是大腦的主要抗氧化劑，氧自由基攻擊Na+-K+-ATP酶中富含的賴氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等，減少GSH的合成，加重氧化應(yīng)激〔9〕;還能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) Na+、Ca2+增加，K+降低，影響跨膜Na+濃度梯度的重建，進(jìn)一步影響Na+-Ca2+交換，加重Ca2+濃度的升高。Aβ還會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高〔10〕，Ca2+超載也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡，從而導(dǎo)致離子通道開放，谷氨酸大量釋放到突觸間隙或直接影響谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLT)-1和谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)的活性功能，從而導(dǎo)致突觸間隙谷氨酸濃度的異常增高及線粒體功能失調(diào)〔11〕，刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體過度興奮〔12〕，細(xì)胞代謝紊亂。

二氮嗪在有神經(jīng)細(xì)胞毒性物質(zhì)Aβ1～42長(zhǎng)時(shí)間如72 h存在時(shí)，首先Aβ1～42啟動(dòng)了細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，二氮嗪預(yù)開放線粒體ATP敏感鉀離子通道，它的開放對(duì)維持線粒體膜電位的極化狀態(tài)有極其重要的作用。K+主要自細(xì)胞質(zhì)流向線粒體內(nèi)，離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)形成線粒體膜電位的升高〔13〕，細(xì)胞膜超極化或復(fù)極化，抑制電壓依賴性鈣通道的開放，減少Ca2+通過L型通道內(nèi)流，以及Na+-Ca2+交換的逆轉(zhuǎn)〔14〕，有益于減少細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣超載，增強(qiáng)細(xì)胞在代謝應(yīng)激條件下的活性。線粒體膜電位升高在一定程度上可以減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基的生成，減少了氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生自身保護(hù)作用，保護(hù)了神經(jīng)細(xì)胞活性，維持了細(xì)胞的ATP正常代謝，促進(jìn)了細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶的生理功能，增強(qiáng)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)K+的功能，從而增加了Na+-K+-ATP酶β亞基蛋白表達(dá)水平;還使線粒體基質(zhì)體積增加，能夠激活脂肪酸氧化及電子轉(zhuǎn)移，促進(jìn)ATP的生成，有利于神經(jīng)細(xì)胞的存活〔15〕。

但是，二氮嗪在有神經(jīng)細(xì)胞毒性物質(zhì)Aβ1～42較短時(shí)間如24 h存在時(shí)，一方面，有研究表明，當(dāng)胞內(nèi)ATP水平低到某一臨界值時(shí)，KATP通道被激活發(fā)揮作用〔16〕。另一方面，Aβ1～42作用導(dǎo)致細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)還沒有啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，即使當(dāng)二氮嗪預(yù)開放 KATP通道，鉀離子主要自細(xì)胞質(zhì)流向組織間液，還沒有流向線粒體內(nèi)?？赡?4 h細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)主要發(fā)生在細(xì)胞間質(zhì)，而不是線粒體內(nèi)。因此，Aβ1～42和二氮嗪共同作用24 h，并沒有明顯地影響到 Na+-K+-ATP酶β亞基的生理作用，可能是二氮嗪與Aβ1～42共同作用對(duì)Na+-K+-ATP酶β亞基的影響呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

另有研究證實(shí)二氮嗪作用神經(jīng)細(xì)胞可導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，在健康細(xì)胞中此作用可能不明顯〔17〕，當(dāng)單獨(dú)二氮嗪作用神經(jīng)細(xì)胞時(shí)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響Na+-K+-ATP酶活性。另外，二氮嗪是KATP通道開放劑，開放了KATP通道后，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞胞膜超極化，線粒體內(nèi)膜去極化，K+主要由細(xì)胞質(zhì)外流到組織間液，從而在一定程度上抑制了Na+-K+-ATP酶將2個(gè)K+泵入細(xì)胞內(nèi)的生理作用。因此，24 h和72 h蛋白電泳顯示單獨(dú)應(yīng)用二氮嗪明顯降低了Na+-K+-ATP酶β亞基的蛋白表達(dá)水平。

1 紀(jì) 慧，田 華，劉 富，等.葛根素對(duì)血管性癡呆小鼠腦組織AchE及Na+-K+-ATP酶活性的影響〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013;34(21):3121-3.

2 馬立峰，郭 艾，于浩森，等.鈉鉀ATP酶α亞基表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)性的研究進(jìn)展〔J〕.中華損傷與修復(fù)，2013;8(6):68-71.

3 Marshall WS，Bryson SE.Transport mechanisms of seawater teleost chloride cells:an inclusive model of a multifunctional cell〔J〕.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，1998;119(1):97-106.

4 Kreutz F，Scherer EB，F(xiàn)erreira AG，et al.Alterations on Na+-K+-ATPase and acetylcholinesterase activities induced by amyloid-β peptide in rat brain and GM1 ganglioside neuroprotective action〔J〕.Neurochem Res，2013;38(11):2342-50.

5 付慶喜，馬國(guó)詔，車峰遠(yuǎn)，等.二氮嗪預(yù)處理對(duì)Aβ1～42作用神經(jīng)細(xì)胞KATP各亞基表達(dá)的影響〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011;49(9):24-9.

6 Zeng XW，Wang T，Jiang LL，et al.Diazoxide and cyclosporin a protect primary cholinergic neurons against beta-amyloid(1～42)-induced cytotoxicity〔J〕.Neurol Res，2013;359(5):529-36.

7 Nelson TJ，Alkon DL.Oxidation of cholesterol by amyloid precursor pro-tein and β-amyloid peptide〔J〕.J Biol Chem，2005;280(8):7377-87.

8 Singh RB，Hryshko L，F(xiàn)reed D，et al.Activation of proteolytic enzymes and depression of the sarcolemmal Na+-K+-ATPase in ischemia-reperfused heart may be mediated through oxidative stress〔J〕.Can J Physiol Pharmacol，2012;90(2):249-60.

9 Vitvitsky VM，Garg SK，Keep RF，et al.Na+and K+ion imbalances in Alzheimer's disease〔J〕.Biochim Biophys Acta，2012;1822(11):1671-81.

10 Lawton JS，Hsia PW，Damiano RJ Jr.The adenosine-triphosphate-sensitive potassium-channel opener pinacidil is effective in blood cardioplegia〔J〕.Ann Thora Surg，1998;66(3):768-73.

11 Tickler AK，Wade JD，Separovic F.The role of Aβ peptides in Alzheimer's disease〔J〕.Protein Pept Lett，2005;12(6):513-9.

12 Roselli F，Tirard M，Lu J，et al.Soluble β-amyloid1-40 induces NMDA-dependent degradation of postsynaptic density-95 at glutamatergic synapses〔J〕.J Neurosci，2005;25(48):11061-70.

13 Ding F，Shao ZW，Yang S，et al.Role of mitochondrial pathway in compression-induced apoptosis of nucleus pulposus cells〔J〕.Apoptosis，2012;17(6):579-90.

14 Jahangir A，Terzic A.KATP channel therapeutics at the bedside〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2005;39(1):99-112.

15 Gross GJ.The role of mitochondrial KATP channels in cardioprotection〔J〕.Basic Res Cardiol，2000;95(4):280-4.

16 Liu J，Yin F，Zhang X，et al.Geniposide，a novel agonist for GLP-1 receptor，prevents PC12 cells from oxidative damage via MAP kinase pathway〔J〕.Neurochem Int，2007;51(6-7):361-9.

17 O'Rourke B.Evidence for mitochondrial K+channels and their role in cardioprotection〔J〕.Circ Res，2004;94(4):420-32.