唐萬勇 劉 潔 侯 博, 朱秀高,3 丁文格 陳翠蘭

（1武漢回盛生物科技有限公司袁湖北武漢 430042；2湖北省獸藥工程研究中心袁湖北武漢 430042；3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院袁北京 100193）

氟苯尼考單用及聯(lián)用對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的體外抑菌效果

唐萬勇1劉 潔2侯 博1,2朱秀高1,3丁文格1陳翠蘭2

（1武漢回盛生物科技有限公司袁湖北武漢 430042；2湖北省獸藥工程研究中心袁湖北武漢 430042；3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院袁北京 100193）

為研究氟苯尼考和多西環(huán)素、甲氧芐啶、黏桿菌素的臨床配伍對副豬嗜血桿菌及胸膜肺炎放線桿菌感染的治療效果袁采用棋盤法測定氟苯尼考與其他三種抗生素聯(lián)合使用對上述兩種細(xì)菌的體外抑菌效果。結(jié)果表明:氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)合使用對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的抑菌具有協(xié)同作用 （FIC=0.75）；與甲氧芐啶聯(lián)合使用均表現(xiàn)為無關(guān)作用（FIC=1.5）；與黏桿菌素聯(lián)合使用對副豬嗜血桿菌呈現(xiàn)無關(guān)作用（FIC=2）袁而對胸膜肺炎放線桿菌呈現(xiàn)協(xié)同作用（FIC=0.75）。

副豬嗜血桿菌；胸膜肺炎放線桿菌；氟苯尼考；最小抑菌濃度；聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

氟苯尼考（Florfenicol）是一種化學(xué)合成的酰胺醇類廣譜抗菌藥，最早于1979年上市，中國于1999年批準(zhǔn)使用，用于治療敏感菌引起的豬等動(dòng)物的細(xì)菌性疾病[1]。其作用機(jī)理是通過與細(xì)菌核糖體50s亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，由此起到抗菌作用。該藥具有抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣泛、相對比較安全的特點(diǎn)，在養(yǎng)豬生產(chǎn)上，廣泛用于防治大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、各類鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌等所致的細(xì)菌性疾病，尤其是在豬呼吸道疾病的控制中[2,3]。

副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌是豬的兩種重要的細(xì)菌性病原，尤其在豬呼吸道疾病的混合感染中起到重要作用。副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）由德國學(xué)者G lasser發(fā)現(xiàn)，于1910年首次報(bào)道，至少具有15個(gè)血清型，可導(dǎo)致多發(fā)性漿膜炎，包括胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。副豬嗜血桿菌病是規(guī)模化養(yǎng)豬場最常見的細(xì)菌性疾病[4]，在豬群的分離比例僅次于鏈球菌，占比達(dá)到22.5%[5]。胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus p leuropneumoniae,APP）由Pattison于1957年首次報(bào)道，到目前為止已知有15個(gè)血清型。胸膜肺炎放線桿菌是生長育肥豬群的重要病原[4]，常導(dǎo)致豬只猝死、胸膜肺炎和生長不良。由于HPS和APP血清型眾多，疫苗免疫常常面臨交叉保護(hù)作用不強(qiáng)的問題，影響其防控效果，所以抗菌藥物成為控制這兩種病的主要手段，臨床上，氟苯尼考是控制這兩種疾病最常用的抗菌藥之一。

隨著氟苯尼考在豬細(xì)菌性疾病，尤其是HPS和APP控制中的大量廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性逐年上升，耐藥菌株流行[6]。國內(nèi)已有報(bào)道重慶部分地區(qū)副豬嗜血桿菌對氟苯尼考的耐藥率達(dá)到29%[7]，湖南部分地區(qū)胸膜肺炎放線桿菌對氟苯尼考的耐藥性也已達(dá)到20%[8]，給疾病的治療和控制帶來了巨大挑戰(zhàn)，尋找合理的聯(lián)合用藥已成為控制耐藥菌感染和延長現(xiàn)有抗生素使用壽命亟待解決的問題。因此本研究篩選與氟苯尼考聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用的抗生素，為APP和HPS感染的治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

副豬嗜血桿菌SH0165株為血清5型的地方分離強(qiáng)毒株[9]，胸膜肺炎放線桿菌JL03株為血清3型的臨床分離株[10]，均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物傳染病分室提供。兩種細(xì)菌均在添加8%胎牛血清和5‰NAD的TSA固體培養(yǎng)基或TSB液體培養(yǎng)基中生長。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）購自英國OXOID公司；四季青無菌胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自美國Sigma公司，配制成1mg/m L的儲存濃度，過濾除菌備用。

氟苯尼考：江蘇恒盛藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號FB1503032；鹽酸多西環(huán)素：揚(yáng)州聯(lián)博藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號YD141001100；硫酸黏桿菌素：山東魯抗舍里樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號1411016；甲氧芐啶（TMP）：壽光富康制藥有限公司生產(chǎn)，批號YR20140173。稱取以上四種抗生素適量，溶于相應(yīng)量的溶劑中，使?jié)舛葹? 120μg/m L，過濾除菌，-20℃保存。

1.3 體外MIC的測定

按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）（M100-S19）推薦的肉湯微量稀釋法進(jìn)行。將待測菌株分別接種液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈1.0（相當(dāng)于108CFU/m L），用液體培養(yǎng)基校正菌液濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛龋瑢⒕合♂尩?07CFU/m L，備用；在96孔板中TSB培養(yǎng)基（含血清和NAD），在第一孔加入適當(dāng)體積的抗生素儲存液，后續(xù)孔進(jìn)行2倍梯度倍比稀釋；將之前稀釋好的菌液加入微孔板中，使菌液終濃度達(dá)到105CFU/m L，每孔總體積為100μL。同時(shí)做陰陽性對照，37℃條件下，APP培養(yǎng)16～20小時(shí)，HPS培養(yǎng)48小時(shí)，讀取抗生素對菌株的最小抑菌濃度即為MIC，每次試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，重復(fù)三次。

1.4 聯(lián)合用藥的體外抑菌試驗(yàn)

用棋盤法測定氟苯尼考與多西環(huán)素、黏桿菌素和TMP聯(lián)合的體外抑菌活性。將儲存濃度的抗生素配制成2.5、5、10、20、40倍MIC的濃度，參照MIC測定的方法，分別將兩種抗生素加入到同一個(gè)孔中，使各孔中的藥物最終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4倍MIC的濃度。另設(shè)陽性對照和陰性對照。重復(fù)棋盤試驗(yàn)3次，每次3個(gè)重復(fù)。氟苯尼考與其他抗菌劑的聯(lián)合用藥試驗(yàn)以抑菌濃度指數(shù)（Fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）作為判斷依據(jù)[11,12]。FIC的計(jì)算公式為：

FIC=甲藥聯(lián)合時(shí)的MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)的MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)的MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)的MIC

當(dāng)FIC≤0.75時(shí)判為協(xié)同作用，1.00≥FIC＞0.75時(shí)判為相加作用，2.00≥FIC＞1.00時(shí)判為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2.00時(shí)判為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 抗生素單用MIC的測定結(jié)果

氟苯尼考、多西環(huán)素和黏桿菌素單用對副豬嗜血桿菌SH0165株和胸膜肺炎放線桿菌JL03株的抑菌MIC較小，均≤1μg/m L，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）的判定標(biāo)準(zhǔn)均為敏感。而TMP對副豬嗜血桿菌SH0165株的MIC為8μg/m L，屬于耐藥；對胸膜肺炎放線桿菌JL03株的MIC為0.25μg/m L，屬敏感，詳見表1。

2.2 抗生素聯(lián)用MIC的測定結(jié)果

采用棋盤法對兩種藥物聯(lián)合使用的體外最小抑菌濃度進(jìn)行了測定，結(jié)果見表2。其中氟苯尼考和多西環(huán)素聯(lián)用后，對副豬嗜血桿菌SH0165株和胸膜肺炎放線桿菌JL03株的FIC=0.75，均呈現(xiàn)協(xié)同作用；而和TMP聯(lián)用后均呈現(xiàn)無關(guān)作用（FIC=1.5）。氟苯尼考和黏桿菌素聯(lián)用后，對副豬嗜血桿菌SH0165株呈現(xiàn)無關(guān)作用（FIC=2），對胸膜肺炎防線桿菌JLl03株呈現(xiàn)協(xié)同作用（FIC=0.75）。

表1 幾種抗生素單用的MIC測定結(jié)果 （μg/m L）

表2 氟苯尼考聯(lián)合其他藥物對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的抑菌效果 （μg/m L）

3 討論

最近十余年，國內(nèi)外學(xué)者對氟苯尼考開展了大量的體外抑菌試驗(yàn)，證實(shí)其對胸膜肺炎防線桿菌、豬鏈球菌高度敏感[2]。同時(shí)，大量臨床試驗(yàn)表明，氟苯尼考治療鏈球菌病和胸膜肺炎的效果也比較顯著，在臨床癥狀、肺病變計(jì)分、日增重、血清學(xué)試驗(yàn)等指標(biāo)上，效果優(yōu)于其他抗菌藥[13]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考對傳染性胸膜肺炎的敏感性仍高于其他抗生素[14]。但隨著抗菌劑的大量使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，目前在部分豬場使用氟苯尼考等常用抗菌劑對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌感染的治療效果下降；因此，篩選具有協(xié)同作用或累加作用的抗生素組合，可以為臨床確定合理的給藥方案，提高療效和治愈率，還可部分解決耐藥菌株引起的感染，并防止耐藥菌株的出現(xiàn)，延長抗生素的使用壽命，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究采用臨床控制呼吸道疾病的最主要的抗生素——氟苯尼考與其他常用抗生素聯(lián)合使用，測定FIC判斷是否具有協(xié)同作用。經(jīng)過聯(lián)合用藥測定和計(jì)算，氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)合使用對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌均具有很好的協(xié)同作用，與報(bào)道的氟苯尼考與多西環(huán)素聯(lián)合使用對愛德華氏菌的抑菌效果呈現(xiàn)相加作用[15]和對豬源大腸桿菌的抑菌效果呈現(xiàn)協(xié)同或相加作用、縮小耐藥突變選擇窗[16]等結(jié)果相一致；氟苯尼考與黏桿菌素聯(lián)合使用對胸膜肺炎放線桿菌也同時(shí)具有協(xié)同作用，與文獻(xiàn)報(bào)道對豬大腸桿菌和鏈球菌具有協(xié)同作用[17]的結(jié)果相似，而對副豬嗜血桿菌卻呈現(xiàn)無關(guān)作用。因此，以上結(jié)果提示在體內(nèi)治療由于副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌引起的感染時(shí)，兩藥聯(lián)用或可減少氟苯尼考及多西環(huán)素的用量，或提高療效。

經(jīng)試驗(yàn)測定，氟苯尼考和多西環(huán)素聯(lián)合用藥，對副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的抑菌配伍比例均為4∶1，可呈協(xié)同作用。氟苯尼考和黏桿菌素聯(lián)合用藥，對胸膜肺炎放線桿菌的抑菌配伍比例為4∶1，也具有協(xié)同作用。在臨床上按照此比例進(jìn)行合理組合用藥，可以很大程度上節(jié)約抗生素的使用量或大大提高療效，節(jié)約治療費(fèi)用和成本；或者在同樣使用劑量和濃度下更為有效殺滅和抑制耐藥菌的感染。這對氟苯尼考等的實(shí)際應(yīng)用、抗生素的聯(lián)合使用或者復(fù)方制劑的研制具有重要意義。

致謝：

本試驗(yàn)所用的副豬嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌為周銳教授提供，試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和獸醫(yī)微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室完成，在此一并表示感謝。

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A

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2015-10-19