周建紅等

摘要：按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 772-2004）設(shè)計(jì)合成了針對(duì)H5的引物，建立了一種對(duì)禽流感（AIV）一步法RT-PCR的快速診斷方法。結(jié)果表明，該方法具有高效，快速，特異性強(qiáng)，敏感性高等特點(diǎn)，可基本滿足當(dāng)前的檢測(cè)需要。

關(guān)鍵詞：禽流感；RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S858.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2015）07-0011-02

禽流感是由A 型流感病毒（AIV）引起的一種禽類的疾病綜合征。因其傳播快、危害大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[1]。該病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)危害性極大，是世界各國(guó)防疫的重點(diǎn)對(duì)象?？刂魄萘鞲嘘P(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早預(yù)防。因而快速、敏感、特異的診斷方法受到人們的關(guān)注。目前對(duì)AIV進(jìn)行快速檢測(cè)的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、Real-time RT-PCR、NASBA和Microarray等。隨著PCR技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，該技術(shù)已逐漸應(yīng)用于各類疫病的診斷。對(duì)于禽流感檢測(cè)，它可通過(guò)基因序列和結(jié)構(gòu)分析，從分子和基因水平直接對(duì)臨床病料或雞胚培養(yǎng)物進(jìn)行禽流感病毒（AIV）型、亞型及不同毒力株的檢測(cè)[2]。本文就RT-PCR技術(shù)檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的試驗(yàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）禽流感病毒陽(yáng)性對(duì)照（已滅活）。

（2）主要試劑：RNA提取試劑盒為美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品。RT-PCR試劑盒為寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品。低分子量蛋白質(zhì)Marker、瓊脂糖為OXOID產(chǎn)品。

（3）引物：根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 772-2004）合成了1對(duì)引物，上游引物（P1）：5′-ACACATGCYCARGACATACT-3′；下游引物（P2）：5′-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3′；引物之間跨度為545 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 病毒總RNA的提取

采集的口腔、泄殖腔棉拭子分離后收集上清，RNA 病毒的抽提按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 RT-PCR反應(yīng)

RT-PCR采用一步法，參照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）（TaKaRa）操作說(shuō)明，利用上述引物P1、P2分別對(duì)提取的RNA進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 反應(yīng)體系如下：10×One step RNA PCR Buffer（TaKaRa）5 μL，dNTP（10 mmol/L）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）10 μL，RNase Inhibitor （40 U/μL）1 μL，AMV RTase XL（5 U/μL） 1 μL，AMV-Optimized Taq（5 U/μL）1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，RNA 模板3 μL，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.4 特異性試驗(yàn)

取CSFV、PRRSV、NDV按照OMEGA說(shuō)明書提取總RNA，按照1.3進(jìn)行RT-PCR。

1.5 RT-PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

RT-PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至適當(dāng)位置，在長(zhǎng)波紫外燈下/凝膠成像系統(tǒng)觀察或拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽流感RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性對(duì)照獲得大小為545 bp 左右的片段，與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一致（圖1）。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，僅禽流感陽(yáng)性株在545 bp處出現(xiàn)了一條帶，而CSFV、PRRSV、NDV均為陰性。

2.3 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

從某雞場(chǎng)采集40份樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，未見有陽(yáng)性。

3 小結(jié)與討論

H5亞型禽流感由于在家禽中流行較為廣泛、危害大，特別是高致病性禽流感可引起雞群100%死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。

為進(jìn)一步減少損失，及時(shí)對(duì)禽流感的發(fā)生做出早期診斷，并進(jìn)行預(yù)警預(yù)報(bào)，我們按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 772-2004）設(shè)計(jì)合成了針對(duì)H5的引物，建立了一種對(duì)AIV一步法RT-PCR的快速診斷方法，該方法具有高效，快速，特異性強(qiáng)，敏感性高等特點(diǎn)，可基本滿足當(dāng)前的檢測(cè)需要，為禽流感的預(yù)防和確診提供了保障。

參考文獻(xiàn)：

[1] 卡爾尼克B W.禽病學(xué)[M].第九版.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.199l.

[2] 彭曉玲，蘭 玲，馬亞珍，等. 高致病性禽流感RT-PCR快速診斷方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（1）： 40-42.