唐承成　曾琛　姜于蘭

摘要：2014年6～10月在貴州煙草主栽區(qū)對煙草赤星病病原菌進行了分離鑒定，鑒定出2種病原菌，即鏈格孢菌（Alternaria alternata （Fr.） Keissler）和長柄鏈格孢菌（Alternaria longipes（ELL.&Ev）Mason）。

關(guān)鍵詞： 烤煙； 煙草赤星??； 病原菌鑒定

中圖分類號：S432.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）15-3656-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.017

Abstract： From June to October in 2014， pathogenic fungi of tobacco brown spot was separated and identified in tobacco′s main area in Guizhou. 2 kinds of pathogenic fungies had been obtained，which were Alternaria alternata （Fr.） Keissler and A. longipes （ELL & Ev） Mason.

Key words： flue-cured tobacco； tobacco brown spot； pathogenic identification

煙草赤星病于1892年在美國首先被發(fā)現(xiàn)，1931年從發(fā)病的感染葉片中篩選出其病原交鏈孢菌（A. longipes（ELL.&Ev）Mason），1971年定名為（Alternaria alternata （Fries） Keissler）[1，2]。赤星病具有潛伏期短、流行速度快的特點，在環(huán)境有利于發(fā)病的情況下，短時間內(nèi)即可造成大面積流行，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大損失。在貴州煙區(qū)，通過2004～2008年的調(diào)查，全省平均病情指數(shù)為1.56，發(fā)病較重的年份平均病情指數(shù)高達2.51，年度重發(fā)病煙區(qū)常常造成毀滅性災害。貴州省常年植煙總面積近20萬hm2，每年因赤星病造成的煙葉產(chǎn)值損失平均達2 500多萬元[3，4]。為了更好的防治煙草赤星病，本研究對貴州煙草赤星病進行了病原菌的鑒定。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查時間和地點

2014年6～10月在貴州煙草主栽區(qū)天柱縣、開陽縣、威寧縣、道真縣、興義縣、普定縣等地進行調(diào)查。

1.2 病害標本采集

采集到病害癥狀典型的葉片立即拍照、編號、記錄采集人、時間、地點及主要發(fā)病特征，并將標本放入經(jīng)過滅菌的信封中帶回實驗室。

1.3 病原菌的分離純化

在病部有明顯病征處直接挑取菌絲進行分離培養(yǎng)，觀察有分生孢子器并產(chǎn)生大量分生孢子的，用單孢分離法分離病原菌。對于沒有明顯病征的，采用常規(guī)分離方法進行病原菌的分離。

1.3.1 單孢分離法 參考邱小燕等[5]的單孢分離法并加以改進。具體方法為，先用75%乙醇消毒30 s后，用無菌水清洗3次。之后用鑷子夾起病斑，置于滅菌濾紙上吸干多余水分，再用剪刀將病斑部分剪下邊長約2 mm小塊。用滅過菌的手術(shù)刀將病斑小塊在干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)切碎，然后將其轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管內(nèi)，加入1 mL無菌水配成孢子懸浮液，再吸取60 μL孢子懸浮液均勻涂布于加入雙抗的PDA平板上。適宜溫度下傾斜放置12 h，最后在10/40倍顯微鏡下挑取萌發(fā)的單個孢子于加入雙抗的PDA平板上。

1.3.2 組織分離法 病部葉組織表面經(jīng)消毒后，切取病葉交接處的組織，移在PDA上培養(yǎng)。表面消毒可用升汞水或用火焰灼燒（不影響組織內(nèi)的病原），最常用的消毒方法是在75%的乙醇中浸過后將乙醇揮發(fā)掉。

1.3.3 病原菌的純化 切取或挑取分離得到的培養(yǎng)物邊緣較純的部分于新的平板培養(yǎng)基上，如此反復幾次，得到病原菌的純培養(yǎng)。

1.4 病原菌的鑒定

以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定為主，對于形態(tài)學難以鑒定的疑難屬、種，結(jié)合分子生物學方法進行鑒定。

1.4.1 病原菌形態(tài)特征觀察 對分離得到的病原菌，觀察其在PDA上的培養(yǎng)性狀，包括菌落的形狀、大小、顏色等，觀察菌絲及分生孢子的形態(tài)特征，描述其形態(tài)，并測量大小，進行顯微拍照等。然后根據(jù)病害組織的癥狀，結(jié)合病原菌形態(tài)特征進行病原菌鑒定[6，7]。

1.4.2 病原菌的分子生物學鑒定 用CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法提取病原菌的總DNA，具體步驟如下：①收集培養(yǎng)4～7 d的菌絲約0.2 g，在液氮中迅速研磨成粉末后，把粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管中，然后加入700 μL 2%CTAB（2%PVP，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，25 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl）緩沖液，混合均勻；②于65 ℃水浴鍋中加熱1 h，期間輕輕搖勻3次；③從水浴鍋中取出，冷卻至室溫后，加入等體積（700 μL）的氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻10 min，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管；④在上清液中加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10～20 min；⑤4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，倒出上清液；⑥用200 μL 75%乙醇洗滌2～3次除鹽（可置于-20 ℃冰箱中過夜）；⑦37 ℃干燥20 min，沉淀回溶于600 μL ddH2O中，并用等體積的飽和酚（Tris平衡酚）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提1～3次，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中；⑧用等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提1～3次，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，吸取上清液；⑨于上清液中依次加入1/10體積的4 mol/L的NaAc溶液、2倍體積的無水乙醇，靜置20 min后，4 ℃10 000 r/min離心5 min，收集沉淀DNA；⑩沉淀用200 μL 75%乙醇洗滌2～3次，干燥后溶于適量ddH2O中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.4.3 PCR及測序 利用真菌核糖體rDNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）PCR擴增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取的總DNA進行PCR擴增，引物由上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR擴增反應體系為：9.5 μL ddH2O，12.5 μL 2×Taq MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]，正反引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃充分延伸7 min，4 ℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物的檢測及測序：經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，BIO–RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照、保存。將產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較。根據(jù)同源性比較結(jié)果，結(jié)合病原菌的形態(tài)學特征，鑒定出病原菌。

1.5 回接試驗

供接種的離體葉片來自貴州省煙草科學研究所，品種為云煙87。將健康新鮮葉片進行75%乙醇表面消毒，并用無菌水沖洗，用大頭針（高溫灼燒消毒）在葉片兩側(cè)的葉基處、葉中部、近葉尖處共6處刺穿，葉片在2×106 個孢子/mL孢子懸浮液中浸泡30 s后瀝干（對照葉片在無菌水中浸泡30 s后瀝干），將葉片置于2層濾紙上，于26 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)5 d。記錄回接結(jié)果，并對回接發(fā)病的組織進行癥狀觀察記錄和病原菌的分離，如果回接發(fā)病組織的癥狀與煙草赤星病癥狀相同或相似，且分離得到的培養(yǎng)物與之前回接上去的一致，則確認此菌為煙草赤星病的病原菌。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)形態(tài)學與分子生物學綜合鑒定分析，病原菌有2種，一種為鏈格孢菌，另一種為長柄鏈格孢菌，這兩種菌均為半知菌亞門鏈格孢屬。

2.1 鏈格孢菌

形態(tài)特征：菌落圓形，正面黑色，疏松，產(chǎn)生圈狀的輪紋，發(fā)病葉片保濕12 h后有菌絲產(chǎn)生，出現(xiàn)少量煤層。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)孢1 d后的未成熟孢子橢圓形，無色或淺黑色，單孢。4～5 d后分生孢子成熟，棕黑色，倒梨狀，有1～7個橫隔，0～3個縱隔，孢子呈珠串狀或放射狀，每條鏈上的分生孢子不超過5個。有些分生孢子會產(chǎn)生假喙，有些假喙比孢身長。成熟的分生孢子大小為29.2 μm× 11.2 μm（圖1）。

分子生物學鑒定：以菌株HGUP1606（病葉分離得到）基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4引物進行PCR擴增，產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，得到HGUP1606的ITS區(qū)序列，經(jīng)BLAST并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較，鑒定結(jié)果為鏈格孢菌。

2.2 長柄鏈格孢菌

形態(tài)特征：菌落圓形，正面黑色，疏松，產(chǎn)生圈狀的輪紋，發(fā)病葉片保濕12 h后產(chǎn)生大量煤層。菌落在PDA上與PCA上有很大的差別，在PDA上菌落也是圓形，但是輪紋不明顯。菌落上還出現(xiàn)白色的菌絲。在煙葉上的孢子與PCA上的孢子更加相近，PDA上的營養(yǎng)物質(zhì)與煙葉本身相差較大，因此在PDA上產(chǎn)生的分生孢子與前兩者有一定的差異性。光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，4～5 d后分生孢子成熟，棕黑色，倒梨狀，有1～7個橫隔，0～3個縱隔，孢子呈珠串狀，無假喙，呈單鏈，每條鏈上有4～10個孢子。成熟的分生孢子大小為29.6 μm×10.9 μm（圖2）。

分子生物學鑒定：以菌株A225基因組DNA為模板，以ITS1和ITS4引物進行PCR擴增，產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，得到菌株A225的ITS區(qū)序列，經(jīng)BLAST并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較，鑒定結(jié)果為長柄鏈格孢菌。

2.3 回接鑒定

經(jīng)回接保濕培養(yǎng)5 d后，能產(chǎn)生煙草赤星病的典型癥狀，并重新分離分別得到鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌2種病原菌。

3 小結(jié)

通過對貴州煙草主栽區(qū)煙草赤星病真菌病害調(diào)查及標本采集和病原菌的分離鑒定，得到貴州煙草赤星病上2種病原菌，但是欠缺的是并沒對2種病原菌進行進一步病原菌致病力強弱的研究，同時有關(guān)報道稱煙草赤星病病原菌有第三個種[8]，但是在貴州并未發(fā)現(xiàn)，有待進一步調(diào)查研究。

參考文獻：

[1] LUCAS G B. Alternaria alternata （Fries） Keissler， the correct name for A. tenuis and A. Longipes[J].Tobacco Science，1971， 15：37-42.

[2] NORSE D. Some factors influencing spore germination and penetration of Alternaria longipes[J]. Annals of Applied Biology，1973，74（3）：297-306.

[3] 徐亞中，謝德平，李花亭，等.煙草赤星病發(fā)生流行規(guī)律和藥劑防治研究[J].中國煙草，1993（1）：18-21.

[4] 劉許生，孔繁武，廖和平.烤煙赤星病發(fā)生與氣象因子的關(guān)系及預測模式建立[J].江西植保，2005，28（4）：152-153.

[5] 邱小燕，湯智鵬，張 敏，等.一種適用于多數(shù)植物病原真菌的單孢分離方法[J]安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（9）：5263-5264.

[6] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1979.

[7] 方中達.植病研究方法[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[8] 彭希文，劉光珍，楊永柱，等.云南省煙草赤星?。═obacco brown spot）病原研究及其防治藥劑的篩選[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報，2000，22（2）：153-156.