張曉芬　冶貴生　馬玉花等

摘要：提取藏羊脾臟總RNA，設(shè)計(jì)DQB1基因引物并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后利用生物軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，藏羊DQB1基因長(zhǎng)度為786 bp，編碼261個(gè)氨基酸。藏羊DQB1基因與參考美利奴羊DQB1基因、中國(guó)美利奴細(xì)毛羊MHCⅡ抗原基因、山羊DQB1基因的核苷酸序列同源性依次為95.8%、95.9%、95.3%，氨基酸序列同源性依次為91.2%、92.0%、91.2%。

關(guān)鍵詞：藏羊；DQB1基因；RT-PCR；序列分析

中圖分類號(hào)：Q75；S826.8+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）15-3784-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.053

Abstract： Total RNA from spleen of Tibetan sheep was extracted and reverse transcribed， and primers of DQB1 gene were designed for PCR amplification. Moreover， the gene sequence was analyzed by DNAStar software after the PCR products was sequenced. The results showed that the length of DQB1 gene was 786 bp， encoding 261 amino acids， and compared with DQB1 gene of Merino sheep， MHC Ⅱantigen gene of Merino Fine-Wool sheep and DQB1 gene of goat， the nucleotide sequence homology of Tibetan sheep were 95.8%， 95.9%， 95.3% respectively， and the amino acid sequence homology were 91.2%， 92.0%， 91.2% respectively.

Key words： Tibetan sheep； DQB1 gene； RT-PCR； sequence analysis

藏羊是中國(guó)三大原始綿羊品種之一，青海是主產(chǎn)區(qū)，分為高原型、山谷型和歐拉型。藏系綿羊具有耐粗飼、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良種質(zhì)特性[1]。綿羊的主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatility complex，MHC）是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的重要基因[2]，分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類分子，其中MHC Ⅱ類分子的DRB和DQB基因編碼產(chǎn)物在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。Sauermann等[4]研究表明MHC-classII Mamu-DQB1基因可以減緩猴免疫缺陷病毒（SIV）感染獼猴的速度。綿羊MHC-DQB1基因的遺傳多態(tài)性與綿羊疾病相關(guān)，如多浪羊基因單倍型DQB1-DF和DQB1-DH與包蟲病的抗性相關(guān)[5]，MHC在抗病育種顯現(xiàn)出重要作用[6]。因此，本研究通過RT-PCR對(duì)藏羊DQB1基因進(jìn)行擴(kuò)增并對(duì)DQB1基因進(jìn)行序列分析，旨在為青海藏羊遺傳資源開發(fā)和抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 脾臟 采自青海高原型藏羊，液氮速凍， -80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 EASY spin Plus組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒為北京艾德萊生物科技有限公司產(chǎn)品；Prime Script反轉(zhuǎn)錄酶、Ex Taq DNA聚合酶、 DL 2 000 DNA Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI登錄的綿羊DQB1基因序列，設(shè)計(jì)藏羊DQB1基因引物，目的基因長(zhǎng)度為786 bp。引物序列如下：DQB1-F：5′-ATGTCTGGGA

TGGTGGCTCTGC-3′，DQB1-R：5′-TCAGCGCACAA

GCCCCTTCT-3′。

1.2.2 總RNA的提取 液氮中研磨脾臟成細(xì)粉后，后續(xù)步驟按試劑盒說明書依次進(jìn)行。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 按照Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書依次進(jìn)行。

1.2.4 DQB1基因的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，DQB1-F 1 μL，DQB1-R 1 μL，cDNA 3 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，滅菌水35.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.5 DQB1基因序列分析 將PCR擴(kuò)增正確的DQB1基因產(chǎn)物送交生物公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)DQB1基因序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏羊總RNA的提取結(jié)果

藏羊脾臟總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）表明，提取的總RNA雖有部分降解，但基本滿足反轉(zhuǎn)錄的要求。

2.2 DQB1基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖2）表明，DQB1基因所在泳道出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照無條帶。

2.3 DQB1基因序列分析

2.3.1 核苷酸序列分析 測(cè)定的藏羊DQB1基因核苷酸序列經(jīng)DNAStar軟件分析表明，DQB1基因核苷酸序列長(zhǎng)度為786 nt，鳥苷酸含量較高，達(dá)到33.72%，整個(gè)基因序列中A+T的含量較低（表1）。

2.3.2 藏羊與參考羊DQB1基因核苷酸與氨基酸序列同源比對(duì)分析 將藏羊DQB1基因與參考美利奴羊DQB1基因（登錄號(hào)：L08792.1）、中國(guó)美利奴細(xì)毛羊MHCⅡ抗原基因（登錄號(hào)：JQ824377.1）、山羊DQB1基因（登錄號(hào)：AY464653.1）的核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖3）表明，藏羊DQB1基因與參考美利奴羊DQB1基因、中國(guó)美利奴細(xì)毛羊MHCⅡ抗原基因、山羊DQB1基因的核苷酸序列同源性依次為95.8%、95.9%、95.3%；藏羊與參考羊DQB1基因核苷酸同源性比較結(jié)果（圖4）顯示，藏羊DQB1基因與美利奴羊DQB1基因之間有3個(gè)堿基的插入及33處核苷酸突變，與中國(guó)美利奴細(xì)毛羊MHC II抗原基因之間有32處堿基突變，與山羊DQB1基因之間有37處堿基突變，堿基突變以A-G、C-T間的轉(zhuǎn)換為主，但也發(fā)生低頻率的A-T、G-C間的顛換；氨基酸序列同源性依次為91.2%、92.0%、91.2%（圖5）。

3 討論

藏羊DQB1基因與美利奴羊DQB1基因、中國(guó)美利奴細(xì)毛羊的MHC II抗原基因的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差異，說明DQB1基因由于遺傳變異可能會(huì)導(dǎo)致不同品種綿羊在抗病力或在對(duì)疾病的敏感程度上存在差異。另外，藏羊DQB1基因、美利奴羊DQB1基因、中國(guó)美利奴細(xì)毛羊MHC II抗原基因與山羊DQB1基因的核苷酸和氨基酸序列差異較小，說明羊DQB1基因具有一定的相對(duì)保守性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 閆忠心，靳義超，白海濤，等.藏羊本品種選育研究現(xiàn)狀與展望[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2014，44（4）：55.

[2] 申 紅，杜迎春，賈 斌，等.多浪羊MHC-DQB1基因多態(tài)性與包蟲病的抗性分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（1）：17-22.

[3] 余智勇，彭林澤，賈 斌，等.綿羊MHC基因的研究現(xiàn)狀[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2006，30（4）：12-13.

[4] SAUERMANN U，KRAWCZAK M，HUNSMANNL G， et al. Identification of Mhc-Mamu DQB1 allele combinations associated with rapid disease progression in rhesus macaques infected with simian immunodeficiency virus[J]. AIDS，1997，11（9）：1196-1198.

[5] 杜迎春.新疆多浪羊和中國(guó)美利奴羊MHC-DRB1、DQB1基因SSCP多態(tài)性與包蟲病抗性研究[D].新疆石河子：石河子大學(xué)，2010.

[6] 惠文巧，侯宏艷，湯繼順，等.綿羊MHCⅡ類基因與疾病相關(guān)性研究進(jìn)展[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，35（11）：1-5.