齊永帥 李貴平 池曉華 杜麗 黃凱 張輝 黃寶丹

目前認為在實體腫瘤中，由于腫瘤生長迅速，造成腫瘤細胞往往處于缺氧狀態(tài)，腫瘤細胞的乏氧程度越高，這些細胞對放療和化療的敏感性越差，臨床上很難被徹底殺死。乏氧顯像作為檢測腫瘤組織乏氧程度的一種無創(chuàng)傷性手段，對于最佳治療方案的選擇、監(jiān)測療效以及預后評價具有重要意義[1-5]。本研究應用放射性核素標記技術(shù)對研制具有臨床應用價值的腫瘤乏氧顯像劑EDTA-MN配體進行標記。99mTc-乙二胺四乙酸-甲硝唑酯（ethylenediaminetetraacetic acid-metronidazole, EDTAMN）是一種2-硝基咪唑類化合物，其中EDTA是一種常見且易得的絡(luò)合劑，為雙功能螯合劑；MN是硝基咪唑類化合物，作為靶向基團濃聚于乏氧組織中，其材料來源廣泛。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 BALB/c裸鼠3只，5周-6周齡，體重20 g左右，SPF級，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)及實驗操作經(jīng)南方醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器 試劑：廣東化工大學輕工業(yè)學院惠贈EDTA-MN配體（圖1）；氯化亞錫（SnCl2）購于廣東光華科技股份有限公司；抗壞血酸（VitC）購于成都市科龍化工試劑廠；高锝酸鈉淋洗液來源于原子高科股份有限公司；無水乙腈購于天津市大茂化學試劑廠；以上試劑均為分析純。聚酰胺膜購于上海摩速科學器材有限公司；Millex?GS 0.22 μm微孔過濾器購于美國Milipore公司。儀器：高效液相系統(tǒng)購于美國Dionex公司；Radio-TLC薄層掃描儀（Bioscan AR-2000）購于美國Bioscan公司；FA604A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；600型恒溫水箱（江蘇金壇市中大儀器廠）；ZD-3回旋振蕩器（天津市歐諾儀器表有限公司）；SN-682型放射免疫γ計數(shù)器（上海核福光電儀器有限公司）；Milliennium VG 型SPECT顯像儀由美國GE公司生產(chǎn)；FJ-391A2型微機放射性活度計由北京核儀器廠生產(chǎn)。

1.3 EDTA-MN配體的99mTc標記 采用氯化亞錫還原法法進行EDTA-MN配體的99mTc標記，分別對EDTA-MN配體反應量（10 mg、5 mg、2 mg）、氯化亞錫用量（8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL）、標記體系pH（2、4、5、6）逐一進行試驗，采用正交試驗設(shè)計進行分析，以尋找最佳標記條件。將含有一定量 EDTA-MN配體的水溶液和新鮮配制0.04 mL SnCl2·2H2O的HCl溶液（0.02 mol/L HCl溶液）依次加入青霉素瓶，調(diào)節(jié)溶液pH值，隨即加入1 mL高锝酸鈉淋洗液（37 MBq），最后再加入30 mg/mL抗壞血酸0.08 mL溶液，于青霉素瓶置于100 ℃水浴中加熱20 min。

1.499mTc-EDTA-MN的標記率和放化純度測定 標記率測定：采用紙層析法，固相為聚酰胺膜，展開劑為60%乙腈水溶液，99mTcO4-、99mTc-膠體、99mTc-EDTA-MN的Rf值分別為0.3-0.5、0.1、0.7-1.0[6]。HPLC純化：采用Kromasil 100-5C18反相柱（250 mm×4.6 mm），流動相為純水與甲醇，A相為純水，B相為甲醇，進樣量5 μL，泵流速1 mL/min。

1.599mTc-EDTA-MN體外穩(wěn)定性測定 經(jīng)HPLC純化后的99mTc-EDTA-MN分別于室溫中放置1 h、3 h、6 h、12 h，然后取少量樣品紙層析法測定放化純度，觀察其體外穩(wěn)定性。

1.699mTc-EDTA-MN的脂水分配系數(shù)測定 取1 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）加入10 mL離心試管，再加入1 mL正辛醇和0.01 mL99mTc-EDTA-MN溶液，蓋上塞子，振蕩、搖勻，離心5 min（4,000 r/min）。然后分別從無機相和有機相中取出0.1 mL，測定二相的放射性計數(shù)，計算其脂水分配系數(shù)P（P=有機相的放射性活度/無機相的放射性活度）。

1.7 荷瘤A549裸鼠模型建立及腫瘤初步顯像 取5周-6周齡BALB/c裸鼠3只，體重20 g左右，于右側(cè)腹壁皮下接種A549細胞2×106/只，待腫瘤生長至直徑1 cm左右時用于顯像。經(jīng)尾靜脈注射標記物 4.62 MBq（0.1 mL），采用低能高分辨準直器，于0.5 h、1 h、2 h、3 h行單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography, SPECT）平面顯像，能峰為140 KeV，矩陣256×256，放大倍數(shù)2.0，采集計數(shù)700 k左右，初步觀察顯像劑在腫瘤病灶的濃聚情況，利用感興趣區(qū)（region of interest, ROI）技術(shù)，計算腫瘤單位面積內(nèi)攝取放射性計數(shù)以及腫瘤/肝臟區(qū)域的放射性計數(shù)比值（T/NT）。

2 結(jié)果

2.199mTc-EDTA-MN的最佳標記條件 EDTA-MN用量5 mg、SnCl2·2H2O用量4 mg/mL、pH值5.0-6.0、反應時間20 min-30 min及反應溫度100 ℃為標記物最佳標記條件，該條件下得到標記率為（84.11±2.83）%。

2.299mTc-EDTA-MN的標記率和放化純度測定 最佳標記條件下，99mTc-EDTA-MN的標記率＞80%，薄層掃描結(jié)果如圖2所示。HPLC結(jié)果顯示制備得到的99mTc-EDTA-MN為一單峰，標準品和標記物在320 nm處紫外吸收峰基本一致，標記物的保留時間約為4 min，放射性化學純度大于90%（圖3）。

2.299mTc-EDTA-MN體外穩(wěn)定性測定 室溫下在生理鹽水中放置1 h、3 h、6 h、12 h后，99mTc-EDTA-MN的放化純度分別為（93.26±1.10）%、（91.97±0.51）%、（90.15±0.63）%、（88.03±0.11）%。結(jié)果表明其放射性化學純度＞90%，在室溫下標記物具有良好的體外穩(wěn)定性。

圖1 配體EDTA-MN的化學結(jié)構(gòu)Fig1 Chemical structures of EDTA-MN

圖2 99mTc-EDTA-MN標記率測定的薄層掃描結(jié)果Fig2 Thin layer chromatography scanning after 99mTc labeling EDTAMN ligand

圖3 99mTc-EDTA-MN的高效液相色譜圖Fig3 HPLC chromatogram of 99mTc-EDTA-MN

2.399mTc-EDTA-MN的脂水分配系數(shù)測定 本試驗重復3次，根據(jù)公式計算得到的平均LogP值，試驗測得99mTc-EDTA-MN的LgP=-3.05，表明為親水性更強的物質(zhì)。

2.4 荷瘤A549裸鼠模型建立及腫瘤初步顯像 荷瘤裸鼠尾靜脈注射標記物后，0.5 h時膀胱區(qū)見大量放射性濃聚，腫瘤部位有放射性濃聚，1 h左右即可顯像清晰，余器官如腦、肺、肝、脾、腎、胃、小腸及肌肉未見明顯放射性濃聚（圖4）。采用ROI技術(shù)測得0.5 h、1 h、2 h、3 h腫瘤部位單位面積內(nèi)放射性計數(shù)分別為88.14±11.59、123.17±9.06、98.08±14.40和79.87±10.57，并計算腫瘤與肝臟區(qū)域的T/NT比值分別為1.95±0.19、3.58±0.78、3.95±0.39和5.01±0.28。

圖4 99mTc-EDTA-MN在非小細胞（A549）肺癌裸鼠模型的不同時間顯像Fig4 99mTc-EDTA-MN imaging of lung tumor in nude mouse bearing A549 cell at different time points

3 討論

作為腫瘤乏氧顯像劑，放射性核素標記的硝基咪唑類化合物目前已得到廣泛的研究。全面了解硝基咪唑類乏氧細胞顯像劑有效地合成方法，將有助于研究者優(yōu)化目標配合物的設(shè)計和選擇高效簡潔的合成方式，從而推動先導配合物的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)優(yōu)化[5,7-9]。放射性核素標記分為直接法和間接法，本研究采用99mTc氯化亞錫還原法與雙功能螯合劑EDTA分子絡(luò)合，利用甲硝唑作為靶向基團濃聚于乏氧組織特點，制備毒性低且穩(wěn)定性好的99mTc-EDTA-MN乏氧顯像劑。在最佳標記條件下，99mTc-EDTAMN得到標記率達到80%以上，放化純度大于90%，并且室溫下在生理鹽水中放置12 h具有良好的體外穩(wěn)定性。標記物經(jīng)HPLC分析，EDTA-MN標準品和99mTc-EDTA-MN的主放射峰值時間約為4 min，且在320 nm處紫外檢測峰基本一致，表明99mTc已成功標記于EDTA-MN上。

近年來報道的99mTc標記的硝基咪唑類乏氧細胞顯像劑普遍存在一些不足：①腫瘤攝取值偏低，顯像時間較晚，體內(nèi)解離快；②肝臟攝取值偏高，肝內(nèi)活性清除能力差，不利于腹部腫瘤的成像；③腫瘤/血液的比值偏低，藥物在血液中清除緩慢。荷瘤裸鼠顯像初步結(jié)果：30 min時膀胱內(nèi)可見大量放射性濃聚，1 h左右腫瘤即可顯影清晰，3 h時腫瘤部位仍有較多放射性滯留，而腦組織、軟組織、甲狀腺、胃腸道等部位放射性分布明顯降低，表明：①標記物在裸鼠體內(nèi)血清除較快，親水性好，主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，其余臟器內(nèi)放射性均較低，有利于減輕對其他器官或組織的輻射損傷；②標記物在體內(nèi)比較穩(wěn)定，無明顯脫標現(xiàn)象。但肝臟有一過性濃聚，經(jīng)過肝臟代謝致使99mTc-EDTA-MN在血液中迅速清除，則有利于降低本底，增加靶/非靶組織放射性比值。雖然裸鼠顯像示瘤體部位有較高的攝取和很好的滯留，但仍需要進行動物體內(nèi)分布實驗，測定各個臟器的組織重量與其放射性計數(shù)得出相應的%ID/g，計算腫瘤攝取值、腫瘤/血液比值、腫瘤/肌肉比值進行實驗驗證，以尋求高效低毒、穩(wěn)定性好、結(jié)合性強的乙二胺四乙酸-甲硝唑酯乏氧細胞顯像劑。

綜上所述，放射性核素標記硝基咪唑類化合物作為乏氧細胞顯像劑是非常具有應用前景的腫瘤診斷藥物。

致謝：感謝廣東工業(yè)大學輕工化工學院實驗室郝志峰教授惠贈EDTA-MN。