安寧 羅心梅 葉蘇娟 王宇 楊蔚菡 蔣倩倩 朱文

肺癌是目前全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。常規(guī)的放化療和手術(shù)都難以取得較好的療效，以致于其5年生存率只有15%-20%。目前認(rèn)為肺癌發(fā)生發(fā)展的主要原因之一是由于基因表達(dá)異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路紊亂。因此，通過(guò)靶向信號(hào)通路中的成員來(lái)調(diào)控異常的信號(hào)通路是突破肺癌治療瓶頸的一種有效的治療方法。其中，信號(hào)通路的特異性拮抗劑已被認(rèn)為是靶向信號(hào)通路異常的極具前景的方法。

Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路，是控制個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要通路之一，參與胚胎發(fā)育的全部過(guò)程，包括胚胎發(fā)生時(shí)早期體軸形成、細(xì)胞分化及各種器官發(fā)育[1]。Wnt配體與Frizzled受體結(jié)合后引發(fā)糖原合成激酶-3β（GSK-3β）從APC/Axin/GSK-3 β復(fù)合體移位及后續(xù)的一系列反應(yīng)。當(dāng)沒(méi)有接受Wnt信號(hào)時(shí)，細(xì)胞間粘附銜接蛋白或共轉(zhuǎn)錄因子（β-catenin）被APC/Axin/GSK-3β復(fù)合物靶向性降解。當(dāng)存在Wnt信號(hào)時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞膜上的Fz受體家族及低密度脂蛋白相關(guān)蛋白家族的LRP5/6相結(jié)合，激活胞內(nèi)的散亂蛋白（Dishevelled, Dvl），從而引發(fā)GSK-3β從APC/Axin/GSK-3β復(fù)合體移位，進(jìn)一步抑制APC/Axin/GSK-3β復(fù)合物降解細(xì)胞質(zhì)中游離的β-catenin，導(dǎo)致β-catenin穩(wěn)定存在且逐漸累積，進(jìn)入細(xì)胞核后與LEF/TCF等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最終激活Wnt基因[2]。目前研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路異常與肺癌的發(fā)生、預(yù)后、治療抵抗相關(guān)，其中拮抗因子失活是造成肺癌中Wnt/β-catenin異常激活的重要原因[3]。

WIF-1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路重要的拮抗劑之一，其編碼蛋白WIF-1通過(guò)在細(xì)胞外隙與WNT配體結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[4]。在肺癌中，Wissmann等[5]發(fā)現(xiàn)WIF-1基因在非小細(xì)胞肺癌中因甲基化發(fā)生下調(diào)的機(jī)率為75.8%，其中腺癌占36.4%（4/11），鱗癌占95.5%（21/22）。此外，Mazieres等[6]也發(fā)現(xiàn)在18對(duì)新鮮肺癌組織中，WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化占到83%（15/18）。Korobko等[7]也分析了48例肺癌患者，其中67%的肺癌病例中出現(xiàn)WIF-1基因表達(dá)下調(diào)。因此，WIF-1的失活可能是肺癌中Wnt/β-catenin通路異常激活的重要原因。在已有的關(guān)于WIF-1抗肺癌的研究中，Kim等[8]利用pcDNA3.1載體構(gòu)建了pcDNA3.1-WIF-1質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞，已經(jīng)證實(shí)WIF-1具有促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡作用，并且伴隨Wnt/β-catenint通路下游靶基因cylcin D1和c-myc的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。而美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì)（Food and Drug Admistraton, FDA）批準(zhǔn)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的載體必須具備卡那抗性，以此來(lái)替代pcDNA3.1中的氨芐霉素抗性篩選基因，最大程度地減少抗性篩選基因和人類基因組發(fā)生重組的可能性，減少治療風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此，為了將來(lái)將WIF-1應(yīng)用于臨床的需要，我們將WIF-1的DNA片段連接到含有卡那抗性的pVAX載體上，構(gòu)建pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)一步探究pVAX-WIF-1對(duì)肺癌細(xì)胞的作用影響。

本研究擬構(gòu)建pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒載體，初步探討pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后WIF-1蛋白表達(dá)水平的變化，在體外對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡及增殖的影響，及在體內(nèi)對(duì)肺癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。本研究旨在為WIF-1基因治療進(jìn)入臨床提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 人質(zhì)粒pBluescriptR-WIF-1購(gòu)于美國(guó)Open Biosystems公司。真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自美國(guó)ATCC（American Type Culture Collection）。大腸桿菌JM109購(gòu)于美國(guó)Clontech公司，由本實(shí)驗(yàn)保種。T4 DNA連接酶、HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶購(gòu)于美國(guó)Fermentas公司；PCR Kit、膠回收試劑盒購(gòu)于日本Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；Hoechst 3235購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Anti-WIF-1購(gòu)于CST公司；HRP標(biāo)記二抗購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；PVDF膜（0.22 μm）購(gòu)自Millipore公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。?xì)胞培養(yǎng)6孔板購(gòu)于美國(guó)Coster公司。雌性免疫缺陷行BALB/c裸鼠（5周齡）購(gòu)于北京華阜康，飼養(yǎng)于無(wú)病原菌的SPF級(jí)動(dòng)物房。陽(yáng)離子脂質(zhì)體（Catonic Liposomes, LPs）由本實(shí)驗(yàn)化學(xué)組制備[10]。

1.2 pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 取購(gòu)買的pBluescriptR-WIF-1菌株劃平板，次日挑取單克隆，進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的菌液進(jìn)行質(zhì)粒小抽提取。下一步以提取的pBluescriptR-WIF-1質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR的方法，擴(kuò)增出WIF-1基因的編碼區(qū)序列，經(jīng)雙酶切連接到pVAX載體上，構(gòu)建含卡那霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXWIF-1。引物以WIF-1在GenBank中的序列BC018037.1為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)：上游引物：5'-GAGGCA AGCTT TGAGCAGCAT GGCCCGGAGGAGCG-3'（酶切位點(diǎn)HindIII）；下游引物：5'-GAAGCTCTAGAC GTTTCAGATGTCGGAGTTCACCAGATGTAATTG-3'（酶切位點(diǎn)XbaI）。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1,188 bp。高保真PCR反應(yīng)體系按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃變性2 min后進(jìn)入25個(gè)PCR循環(huán)（94 ℃、30 s，62 ℃、30 s ，72 ℃、3.5 min），72 ℃、10 min，4 ℃保存。全長(zhǎng)WIF-1基因序列擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物，載體和PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII、XbaI酶切純化后，定向插入pVAX的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切鑒定正確的克隆由上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)分為3組：空白組、pVAX組和pVAX-WIF-1組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到60%時(shí)，將pVAX和pVAX-WIF-1質(zhì)粒分別與Lipofectamine 2000在室溫下共孵育20 min后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。此步驟按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

1.4 Western blot檢測(cè)WIF-1蛋白表達(dá)水平 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX，pVAX-WIF-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。48 h后收細(xì)胞提取蛋白樣品，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。將等量蛋白通過(guò)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)PVDF膜，電壓為86 V，時(shí)間90 min。5%脫脂奶粉4 ℃封閉2 h，TBST洗膜，加入一抗（兔抗人WIF-1單抗和鼠抗人β-actin多抗，稀釋比例為1:1,000），一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次；加入HRP標(biāo)記的二抗（兔抗鼠 IgG 1:5,000），37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，等量的ECL反應(yīng)液A和B混合后加至膜上，顯影。

1.5 pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-WIF-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL（2 μg/μL）MTT液，孵育4 h，小心吸棄上清，再每孔加入150 μL二甲亞砜（DMSO），室溫下，于微孔板振蕩器上振蕩 10 min-20 min，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為492 nm時(shí)的吸光度 (OD值)，計(jì)算出細(xì)胞增殖抑制率 （inhibitory ratio, IR）。每個(gè)組做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX、pVAX-WIF-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，方法同上，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)染空載體pVAX的細(xì)胞為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入1 mL新鮮配制的卡諾氏固定液，靜置10 min-15 min，棄去固定液，再加入1 mL卡諾氏固定液，靜置10 min-15 min。棄去固定液，空氣中干燥5 min，加入1 mL 0.5 μg/mL的Hoechest33258避光染色10 min-20 min后，PBS清洗2次-3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，采用AnnexinV-FITC/PI雙染色法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染pVAX-WIF-1對(duì)肺癌細(xì)胞株凋亡的影響。PBS清洗細(xì)胞2次，加入2 mL不含EDTA的胰蛋白酶消化2 min-3 min，加入含2%BSA的PBS終止消化，輕輕將細(xì)胞吹打下來(lái)。收集細(xì)胞懸液至BD管中，計(jì)數(shù)，1,300 rpm離心5 min。加入適量含2%BSA的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)至106個(gè)，1,300 rpm離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌一次。加入300 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，再加入3 μL AnnexinV-FITC混勻，避光染色5 min，后加入3 μL PropidiumIodide混勻制成單細(xì)胞懸液，室溫避光染色5 min-15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7 pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在體內(nèi)對(duì)肺癌生長(zhǎng)作用影響 以5×106cell/mouse的A549肺癌細(xì)胞100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基懸液對(duì)BALB/c裸鼠進(jìn)行皮下注射，建立皮下瘤模型。當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至（50-100）mm3（平均直徑約5 mm-8 mm）左右時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分成3組：Glucose組、pVAX組和pVAXWIF-1組，每組4只開始治療。質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體分別用5%的葡萄糖水稀釋，按1:4（w/w）的比例復(fù)合。每只小鼠給藥20 μg質(zhì)粒，給藥體系100 μL，進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療。治療期間每周測(cè)量瘤體兩次，瘤體體積按照V （mm3）=0.52 × length（mm）× width2（mm2）公式計(jì)算，直到治療結(jié)束兩周后，處死小鼠，剝離皮下瘤組織，拍照記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的組間差異采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定和測(cè)序 為構(gòu)建pVAX-WIF-1真核表達(dá)質(zhì)粒載體，首先以提取的質(zhì)粒pBluescriptR-WIF-1為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物，克隆WIF-1全長(zhǎng)基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，WIF-1片段大小正確（大小為1,188 bp）。將該WIF-1 PCR產(chǎn)物片段和pVAX載體直接進(jìn)行HindIII和XbaI雙酶切。WIF-1經(jīng)HindIII和XbaI酶切后約為1,176 bp。pVAX載體經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切后由環(huán)狀結(jié)構(gòu)（大小為3,000 bp）變?yōu)?,920 bp的單鏈結(jié)構(gòu)。然后將兩酶切產(chǎn)物純化后經(jīng)T4連接酶進(jìn)行連接，最后得到真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-WIF-1（大小為4,086 bp）。經(jīng)初步電泳篩選正確后，將構(gòu)建的pVAX-WIF-1質(zhì)粒載體進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，WIF-1片段大小約為1,188 bp；雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，pVAX-WIF-1質(zhì)粒載體經(jīng)HindIII和XbaI雙酶切后得到1,176 bp和2,920 bp左右兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。陽(yáng)性克隆測(cè)序和比對(duì)結(jié)果顯示真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-WIF-1構(gòu)建成功，該載體含有WIF-1全長(zhǎng)編碼序列且無(wú)堿基突變。

2.2 pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中WIF-1的表達(dá)檢測(cè) 以Lipofectamine 2000介導(dǎo)pVAX，pVAX-WIF-1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載pVAX的A549細(xì)胞為陰性對(duì)照。48 h后分別提取各處理組A549細(xì)胞的總蛋白，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pVAX-WIF-1后，WIF-1蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為42 kDa，與預(yù)期大小相符（圖2）。

2.3 pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的影響 為了研究pVAX-WIF-1對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響，我們將Lipo2000包裹pVAX-WIF-1基因后轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)分為空白、pVAX、pVAX-WIF-1組，pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，加入MTT檢測(cè)。結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞株中，pVAX-WIF-1對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率為55%，與空白和空載比較，pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染后可明顯抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖（圖3，P＜0.01）。

2.4 pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549凋亡檢測(cè) 為探究pVAX-WIF-1對(duì)A549細(xì)胞凋亡作用的影響，我們將Lipofectamine 2000包裹pVAX-WIF-1后轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后經(jīng)Hoechst3235染色，通過(guò)電子熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)，pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，核出現(xiàn)固縮裂解為碎塊，產(chǎn)生明顯的凋亡小體（圖4A）；而轉(zhuǎn)染了空載體或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，少見(jiàn)凋亡小體。進(jìn)一步，將Lipofectamine 2000包裹pVAX-WIF-1后轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，48 h后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示：空白組和空載組的細(xì)胞凋亡率分別為10%和21%，而轉(zhuǎn)染pVAX-WIF-1組的細(xì)胞凋亡率達(dá)到了62%（圖4B和圖4C，P＜0.01）。以上結(jié)果表明pVAX-WIF-1質(zhì)粒在體外具有明顯誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡的作用。

圖1 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-WIF-1的構(gòu)建。A：質(zhì)粒pVAX-WIF-1的構(gòu)建。M：Marker（DL2000）；1：WIF-1 PCR產(chǎn)物；2：WIF-1 PCR產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和XbaI切割并純化；3：載體pVAX經(jīng)HindⅢ和XbaI切割并純化；4：陽(yáng)性克隆的PCR鑒定；5：陽(yáng)性克隆的雙酶切鑒定；B：陽(yáng)性克隆的測(cè)序鑒定（因序列過(guò)長(zhǎng)，此處只顯示以起始碼開始的部分測(cè)序結(jié)果）。Fig1 Construction of eukaryotic expression plasmid pVAX-WIF-1. A: Construction of pVAX-WIF-1 plasmid. M: Marker(DL2000); 1: PCR products of WIF-1; 2: The digested and purified PCR products; 3: The digested and purified pVAX; 4: The positive clones confirmed by PCR; 5: The positive clones confirmed by double restriction enzyme digestion; B: Sequencing analysis of the positive clones (Part of the sequence).

2.5 pVAX-WIF-1轉(zhuǎn)染抑制皮下瘤生長(zhǎng)檢測(cè) 為探究pVAXWIF-1質(zhì)粒在體內(nèi)的抗肺癌的作用，我們建立了A549裸鼠皮下瘤模型，將脂質(zhì)體包裹pVAX-WIF-1后，進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療。如圖5A所示，在pVAX-WIF-1治療組中，WIF-1在瘤體內(nèi)的表達(dá)升高。其治療結(jié)果表明，Glucose組和pVAX組在給藥治療過(guò)程中，小鼠皮下瘤生長(zhǎng)較快，而經(jīng)pVAX-WIF-1治療后的小鼠皮下瘤生長(zhǎng)速度明顯降低（圖5B）。治療結(jié)束后，取小鼠皮下瘤測(cè)量其瘤體體積，pVAX-WIF-1組與Glucose組相比，其皮下瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)50%（圖5C，P＜0.01）。以上結(jié)果說(shuō)明，pVAX-WIF-1在體內(nèi)對(duì)肺癌的生長(zhǎng)也有明顯的抑制作用。而在治療期間，對(duì)各組小鼠的體重變化觀察結(jié)果顯示，各組間和組內(nèi)的小鼠體重差異較小，提示pVAX-WIF-1脂質(zhì)體復(fù)合物對(duì)荷瘤小鼠沒(méi)有明顯毒性（圖5D，圖5E）。

3 討論

圖2 Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVAX-WIF-1 48 h后WIF-1基因的蛋白表達(dá)水平Fig2 Protein expression level of WIF-1 in A549 cells transfected with pVAX-WIF-1 for 48 h by Western blot analysis

圖3 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pVAX-WIF-1基因?qū)549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。**：P＜0.01。Fig3 Inhibition of cell proliferation of A549 cells after transfection with pVAX-WIF-1 by MTT assay. **: P＜0.01.

圖4 WIF-1基因轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。A：Hoechest3235染色檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVAX-WIF-1的細(xì)胞凋亡形態(tài)；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WIF-1基因?qū)549細(xì)胞凋亡的影響；C：流式數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。**: P＜0.01。Fig4 Induction of apoptosis of A549 cells transfected with pVAX-WIF-1 for 48 h. A: Detection of A549 cell apoptosis by Hoechst staining; B: Detection of A549 cell apoptosis by FCM; C: Cell apoptosis ratio of lung cancer A549 cells by FCM. **: P＜0.01.

肺癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)通路過(guò)度激活，使細(xì)胞增殖失控，惡性轉(zhuǎn)化，是肺癌發(fā)生發(fā)展的主要原因。因此，通過(guò)靶向抑癌基因，調(diào)控異常信號(hào)通路是一種極具前景的腫瘤治療方法。

近年來(lái)，基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤中的普遍異常激活的現(xiàn)象，已有研究[11]表明，通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的特異性拮抗劑對(duì)其進(jìn)行調(diào)控可能是抗腫瘤治療的一個(gè)新的方法。目前有研究[12-17]報(bào)道，在鼻咽癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、前列腺瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1后，均能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在腎癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1后，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡并伴隨Wnt/β-catenin信號(hào)通路被下調(diào)[18]。在宮頸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1也觀察到了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[19]。此外，通過(guò)轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1均能在體內(nèi)抑制前列腺瘤和骨肉瘤小鼠皮下瘤的生長(zhǎng)[15,17]。同樣，在肺癌中，Kim等[8]利用pcDNA3.1載體構(gòu)建了pcDNA3.1-WIF-1質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)WIF-1具有下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。這些研究均表明，轉(zhuǎn)染W(wǎng)IF-1能夠通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制包括肺癌等多種腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡，因而為WIF-1的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

圖5 pVAX-WIF-1對(duì)小鼠皮下瘤的抑制效果。A：pVAX-WIF-1在皮下瘤瘤內(nèi)的表達(dá)情況；B：皮下瘤瘤體治療期間生長(zhǎng)曲線；C：治療結(jié)束后剝離的小鼠皮下瘤；D：皮下瘤生長(zhǎng)相對(duì)抑制率；E：皮下瘤小鼠治療期間體重變化。*：P＜0.05，**：P＜0.01。Fig5 Tumor growth inhibition of pVAX-WIF-1 in vivo. A: The expression of pVAX-WIF-1 in subcutaneous tumor; B: The curve of subcutaneous tumor volume; C: The picture of subcutaneous tumors peeled from mice after treatment; D: Relative growth inhibition of subcutaneous tumor; E: Subcutaneous tumor mice body weight curve. *: P＜0.05; **: P＜0.01.

在本研究中，我們通過(guò)高保真PCR擴(kuò)增WIF-1目的片段，并成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX-WIF-1。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將pVAX-WIF-1和pVAX轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞，在蛋白水平檢測(cè)到該基因表達(dá)上調(diào)；經(jīng)MTT法檢測(cè)WIF-1轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌A549細(xì)胞株生長(zhǎng)活性的影響，發(fā)現(xiàn)WIF-1基因轉(zhuǎn)染后可明顯抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。經(jīng)Hoechst染色和Annexin-V聯(lián)合PI雙染經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WIF-1基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了A549細(xì)胞凋亡。在進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，pVAX-WIF-1表現(xiàn)出有效抑制皮下瘤生長(zhǎng)的作用。這些結(jié)果均說(shuō)明構(gòu)建的pVAX-WIF-1可以有效抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。本研究中運(yùn)用的基因載體質(zhì)粒是FDA推薦的唯一可以應(yīng)用于人體實(shí)驗(yàn)的載體質(zhì)粒，且質(zhì)粒本身具有真核基因表達(dá)調(diào)控序列，強(qiáng)啟動(dòng)子pCMV啟動(dòng)子和poly A信號(hào)，可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)重組蛋白等特點(diǎn)[9]。因此，本研究為將來(lái)WIF-1基因應(yīng)用于肺癌的臨床治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。