李瑞明 楊燕 劉莉 萬松 賀昱霖 孟忠吉

·論 著·

HBV臨床分離株復(fù)制型質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

李瑞明 楊燕 劉莉 萬松 賀昱霖 孟忠吉

目的克隆HBV臨床分離株全長基因組，構(gòu)建真核表達(dá)復(fù)制載體，為研究HBV的耐藥機(jī)制提供基礎(chǔ)。方法從乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA，PCR擴(kuò)增HBV全長基因組，經(jīng)SapI酶切后，克隆入p HY106載體，測序分析序列，然后用lipofectamine 2000將重組載體轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，3 d后收集培養(yǎng)上清液，ELISA檢測HBs Ag、HBeAg水平；Real-time PCR檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV含量；Southern印跡檢測細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體。結(jié)果獲得5株HBV臨床分離株均為野生型，其中基因B型3株，基因C型2株。成功構(gòu)建5株HBV臨床分離株的復(fù)制型質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞的上清液中檢測到HBs Ag、HBeAg及HBV DNA，細(xì)胞內(nèi)檢測到HBV復(fù)制中間體。結(jié)論成功克隆并構(gòu)建了HBV臨床分離株復(fù)制型質(zhì)粒，這種復(fù)制型質(zhì)粒將在HBV臨床分離株的耐藥機(jī)制和藥物敏感性等方面研究中發(fā)揮重要作用。

乙型肝炎病毒；臨床分離株；重組體

HBV感染嚴(yán)重威脅人類的健康，我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬例［1］。核苷（酸）類似物已廣泛應(yīng)用于治療乙型肝炎，大多數(shù)患者需要長期治療甚至終身治療，但是隨著治療時間的延長，產(chǎn)生HBV突變，耐藥風(fēng)險增加［2］，LAM耐藥后會降低病毒對其他藥物的敏感性，且rt A181T/sW172突變會增加肝癌的風(fēng)險［3］。因此有必要建立HBV體外復(fù)制表達(dá)系統(tǒng)，研究HBV的耐藥機(jī)制，并針對不同患者體外篩選有效的抗HBV藥物。本研究建立了HBV臨床分離株全長基因組的克隆方法，構(gòu)建了真核表達(dá)復(fù)制載體，并成功在真核細(xì)胞中產(chǎn)生子代病毒，以期為進(jìn)一步研究HBV的耐藥機(jī)制及檢測治療提供技術(shù)平臺。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

采集湖北十堰市太和醫(yī)院住院乙型肝炎患者血清標(biāo)本3 m L于促凝管，分離血清，分裝保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad）；酶標(biāo)儀（德國Thermo Scientific Multiskan FC），定量PCR儀（美國ABI StepOnePlus）；限制性內(nèi)切酶SapI及T4 DNA連接酶購自美國New England Biolabs公司；高保真Taq DNA聚合酶購自羅氏公司；DMEM 培養(yǎng)基、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Hyclone；DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、定量PCR試劑盒購自北京天根；HBsAg、HBeAg、ELISA檢測試劑盒購自北京科美公司。

質(zhì)粒p HYl06及p HYl06-WTA由德國埃森大學(xué)病毒學(xué)研究所陸蒙吉教授提供；大腸桿菌DH5a感受態(tài)購自天根。

人肝癌細(xì)胞系Huh7為本室保存。復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液（FBS MEM）培養(yǎng)基。

二、方法

（一）引物設(shè)計(jì) 參照Günther等［4］HBV全長引物序列設(shè)計(jì)合成。引物序列P1（nt1821-1843）：5′CCGGAAAGCTTATGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCATC3′，P2（nt1825-1804）：5′CCGGAGAGCTCATGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG3′。鑒定引物序列：CMV Forward Primer：5′GACGCAAATGGGCGGTAG 3′，HY130：5′GGA AAC AGC TAT GAC CAT G3′。

（二）HBV DNA抽提 血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA的抽提，參照天根DP316 DNA提取試劑盒操作，其中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV抽提前先加入2μL 1 mol MgCl2和2μL 10 mg/mL DNase I，37℃處理30 min。最后用30μL dd H2O洗脫DNA備用。

（三）HBV全長基因組的擴(kuò)增與檢測 取2μL HBV DNA為模板，引物P1、P2各1.5μL，參照Roche高保真試劑盒說明配制反應(yīng)體系，參照Durantel等［5］的HBV全長PCR參數(shù)，擴(kuò)增HBV全長基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

（四）HBV復(fù)制型質(zhì)粒p HY106-HBV的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后與真核表達(dá)載體p HYl06各2μg分別用限制性內(nèi)切酶Sap I于37℃酶切4 h，回收酶切產(chǎn)物和線性化p HY106載體，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，在Amp抗性平板上篩選陽性克隆。挑取陽性克隆做菌落PCR，引物CMV Forward Primer（5′CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 3′）和Hy130（5′GGAAACAGCTATGACCATG 3′），0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，選取陽性菌落培養(yǎng)過夜抽提質(zhì)粒測序鑒定。

（五）Huh7細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Huh7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。

（六）HBs Ag和HBe Ag的酶聯(lián)免疫吸附檢測培養(yǎng)上清中的HBs Ag和HBeAg水平采用ELISA試劑盒檢測參照說明書進(jìn)行。

（七）HBV DNA檢測 抽提DNA，實(shí)時PCR檢測HBV DNA水平。94℃預(yù)變性2 min，40個循環(huán)；94℃變性15 s，60℃退火延伸15 s。上下游引物：5′TTGATGATCCTGGAA 3′、5′TGCTATGCCTCATCT 3′。

（八）核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體的提取和Southern雜交 核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體的提取參考文獻(xiàn)［6］。核衣殼相關(guān)HBV復(fù)制中間體以1.0%的瓊脂糖凝膠分離，然后于轉(zhuǎn)移緩沖液中轉(zhuǎn)印到GeneScreenPlus尼龍膜上，與DIG標(biāo)記的HBV全長探針雜交，采用成像系統(tǒng)分析雜交信號。

結(jié) 果

一、HBV臨床分離株的全長克隆

5例血清樣本中抽提的HBV DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，均獲得長約3.2 kb的產(chǎn)物，并順利克隆入p HY106載體，分別命名為p HY106-XJH、p HY106-LFR、p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG。經(jīng)測序比對均為野生型全長HBV基因組，5株HBV序列已提交到GeneBank，序列號分別為：KM213037.1、KM213033.1、KM213032.1、KM213035.1和KM213034.1。其中3株為基因B型，2株為基因C型。

二、HBV復(fù)制性克隆在Huh7細(xì)胞中表達(dá)HBs Ag和HBe Ag

p HY106-XJH、p HY106-LFR、p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，72 h ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBs Ag和HBe Ag水平，結(jié)果5個復(fù)制性克隆轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞上清均可檢測到HBs Ag和HBe Ag的表達(dá)，其中p HY106-LYG和p HY106-MRG表達(dá)的HBs Ag與p HY106-WTA水平相當(dāng)，p HY106-XJH、p HY106-LFR和p HY106-WSQ表達(dá)的HBsAg水平較低，所有質(zhì)粒表達(dá)的HBe Ag水平均較低（圖1）。

圖1 Huh7細(xì)胞上清液中HBs Ag和HBeAg的表達(dá)

三、HBV復(fù)制型克隆在Huh7細(xì)胞中產(chǎn)生HBV子代病毒分泌到上清中

HBV復(fù)制型質(zhì)粒（p HY106-XJH、p HY106-LFR、p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG）轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，72 h檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA水平，結(jié)果5個復(fù)制性克隆轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞上清液中均可檢測到高水平（107～109拷貝/m L）HBV DNA（圖2）。

圖2 Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA復(fù)制水平

四、HBV復(fù)制型克隆在Huh7細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生DNA復(fù)制中間體

HBV復(fù)制型質(zhì)粒（p HY106-XJH、p HY106-LFR、 p HY106-WSQ、p HY106-LYG和p HY106-MRG）轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，72 h Southern印跡檢測核心顆粒相關(guān)HBV DNA，結(jié)果5個復(fù)制性克隆轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞內(nèi)均可檢測到HBV復(fù)制中間體，但復(fù)制水平明顯低于p HY106-WTA（圖3）

圖3 Huh7細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制

討 論

HBV的基因組由環(huán)狀的部分雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，長約3.2 kb。其中的2/3為雙螺旋結(jié)構(gòu)，1/3為單鏈。長鏈為負(fù)鏈，短鏈為正鏈。長鏈的5'端與3'端無共價連接，而是與一種蛋白質(zhì)共價相連。長鏈的5'端以250～300對堿基互補(bǔ)結(jié)合。短鏈的長度視病毒而異，一般長約1.6～2.8 kb，約為長鏈的2/3［7］。Günther等［4］通過在負(fù)鏈末端缺口區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR的延伸避免跨越負(fù)鏈末端缺口，大大提高了HBV全長基因組的擴(kuò)增效率。

p HY106載體由Yang等［8］構(gòu)建，含HBV poly（A）尾，高度保守，用Günther方法擴(kuò)增出臨床全長HBV基因序列用Sap I酶切，插入p HY106載體成為HBV復(fù)制子，包含 HBV復(fù)制最小必須序列。p HY106的結(jié)構(gòu)確保HBV在插入p HYl06載體后能在巨細(xì)胞病毒啟動子作用下轉(zhuǎn)錄完整的前基因組RNA。

我們選用了Sap I內(nèi)切酶直接酶切PCR產(chǎn)物和p HY106載體，成功構(gòu)建了5個HBV臨床病毒株可復(fù)制型克隆。5個HBV臨床病毒株中B亞型有3例、C亞型有2例。所有克隆在轉(zhuǎn)染3 d后都檢測到了HBs Ag和HBe Ag的表達(dá)，其中HBs Ag的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于HBe Ag。B亞型的HBs Ag表達(dá)高于C亞型，但C亞型的HBeAg高于B亞型。這與B、C亞型的臨床表現(xiàn)的差異性相符［9-11］。Realtime PCR結(jié)果顯示B亞型的病毒含量遠(yuǎn)高于C亞型，這與HBs Ag表達(dá)相似，提示HBs Ag表達(dá)強(qiáng)度與病毒含量成正比。在第3天B亞型的病毒量已經(jīng)達(dá)到108數(shù)量級，C亞型也達(dá)到了106數(shù)量級。

本研究構(gòu)建的HBV臨床病毒株可復(fù)制型克隆在細(xì)胞內(nèi)能夠進(jìn)行高水平復(fù)制，并且表達(dá)較高水平的HBs Ag和HBe Ag。B和C亞型的HBV是中國人群感染的主要基因型。這為進(jìn)一步研究HBV的結(jié)構(gòu)與功能、基因表達(dá)與調(diào)控，以及體外篩選抗HBV藥物等提供了一個很好的技術(shù)平臺。

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Construction and identification of plasmids containing a replication-competent HBV supergenomic DNA derived from patients with chronic HBV infection

LI Rui-ming，YANG Yan，LIU Li，WAN Song，HE Yu-lin，MENG Zhong-ji.

（Institute of Biomedicine，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，China；Research Center of Experimental Medicine，Tongji Hospital of Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

MENG Zhong-ji，Email：zhongji.meng@163.com

ObjectiveTo amplify full length hepatitis B virus（HBV）genome derived from patients with chronic HBV infection，and construct plasmids containing a replication-competent HBV supergenomic DNA.MethodsFull-length HBV genomes were purified from serum of chronic hepatitis B（CHB）patients，and amplified by high fidelity polymerase chain reaction（PCR），The PCR products were then restricted with Sap I and ligated with Sap I-linerized p HY106 plasmid，constructs of which were sequenced and transfected into Huh7 cells.Enzyme-linked immunosorbent assay，real-time PCR，and Southern blot，were performent to investigate the HBV gene expression and replication respectively.ResultsFive HBV wild type isolates（3 of genotype B and 2 of genotype C），denived from CHB patients，were amplified successfully，corresponding replication competent plasmids of which were constructed.In the recombinants-transfected Huh7 cells，high HBV DNA load，and high levels of HBs Ag，and HBeAg were detected in the supernatants，and HBV core associated replicative intermediates were verified.ConclusionThe construction of replication competent plasmids for HBV isolates from CHB patients will play an important roles in the detection and mechanism research for HBV mutation，as well as salvage therapy for patient infected with nucleos（t）ide analogues-associated mutants.

Hepatitis B virus；Clinical isolates；Recombinant

2014-12-15）

（本文編輯：錢燕）

湖北省教育廳重大項(xiàng)目（Z20102101），吳階平基金（2010B10），湖北省自然科學(xué)基金（2014CFB645，2010CDZ036）

442000湖北十堰，十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)研究所（李瑞明，劉莉，萬松，賀昱霖，孟忠吉）；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心（楊燕）

孟忠吉，Email：zhongji.meng@163.com